本文關鍵詞：移植腎慢性排斥反應外周血miRNA表達譜篩查與靶基因預測，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腎移植是治療尿毒癥的最佳手段,移植術后排斥反應的發(fā)生往往不可避免。隨著移植配型技術的進步以及新型免疫抑制劑的開發(fā)使用,腎移植術后急性排斥反應的發(fā)生率顯著下降,但慢性排斥反應仍然嚴重威脅著移植腎的長期存活。移植腎穿刺活檢是診斷慢性排斥反應的金標準,但穿刺活檢屬于有創(chuàng)檢查,存在一定的并發(fā)癥,增加受者的心理及生理負擔。常規(guī)生化檢驗與影像學檢查無法確定是否存在慢性排斥反應,所以,臨床上迫切需要尋找一種無創(chuàng)的、高敏感性、高特異性的生物學指標,能夠實現(xiàn)慢性排斥反應的無創(chuàng)診斷。微小RNA(microRNA、miRNA)是一類內源性單鏈RNA,具有轉錄后調控基因表達的功能。miRNA在人體生長發(fā)育、細胞凋亡等各種病理生理過程中發(fā)揮重要的調控作用,人體內miRNA表達量的改變與各種生理和病理狀態(tài)密切相關,比較不同狀態(tài)下miRNA表達譜可以發(fā)現(xiàn)特征性表達的miRNA,這既是優(yōu)良的疾病標志物,還可用作疾病的防治靶標及機制研究的切入點。目的：1、比較移植腎慢性排斥反應與術后穩(wěn)定恢復受者外周血miRNA表達譜的不同,篩選出特征性表達的miRNA,為實現(xiàn)慢性排斥反應的無創(chuàng)診斷提供參考；2、預測特征性表達miRNA所調控的靶基因,為后續(xù)移植腎慢性排斥反應相關機制研究提供基礎。方法：選擇3例經移植腎穿刺病理明確診斷為“T細胞介導的慢性排斥反應”的受者為實驗組,3例腎移植術后移植腎穿刺病理診斷無異常的受者為對照組。抽取兩組受者外周靜脈血,提取血液RNA,進行純度及完整性檢測、poly(A)加尾、Flash Tag Biotin HSR Ligation標記、Affymetrix-miRNA芯片雜交,掃描儀掃描芯片結果,進行芯片數(shù)據(jù)分析,比較兩組miRNA表達譜差異,篩選出特征性表達的miRNA,運用TaqMan探針的方法進行實時定量熒光聚合酶鏈反應(qRT-PCR)驗證芯片結果。采用mirecords數(shù)據(jù)庫檢索差異表達的miRNA調控的靶基因,初步分析靶基因分布特征。結果：1、兩組血液樣本總RNA濃度均大于34.9ng/ml,在260nm/280nm的吸收峰值均介于1.8-2.1；甲醛變性凝膠電泳結果顯示兩組樣本均出現(xiàn)兩條粗亮而濃的條帶,最上面一條28S和下面一條18S,且28S條帶的亮度幾乎為18S的兩倍。表明抽提的RNA純度及完整性較好,質量檢測合格,未出現(xiàn)明顯降解及污染等跡象。2、miRNA表達譜芯片結果：Affymetrix-miRNA芯片總共檢測了6658種miRNA在兩組之間的表達差異情況,結果顯示34種miRNA表達存在顯著差異(p0.05)；其中12種表達上調,miR-4423-3p上調最明顯(7.09倍),上調表達的miRNA多定位于1號和2號染色體；22種miRNA表達下調,miR-3613-5p下調最明顯(0.08倍),下調表達的miRNA多定位于9號和14號染色體。3、實時熒光定量PCR結果：選取miR-4423-3p和miR-133a-3p進行實時熒光定量PCR驗證,結果顯示miR-133a-3p及miR-4423-3p表達差異倍數(shù)與芯片結果吻合,說明芯片檢測結果可靠。4、靶基因查詢顯示差異表達的34種miRNA共調控約9003種靶基因表達,這些靶基因部分分布在炎癥反應、血管再生、淋巴細胞活化、細胞增殖等方面。結論：腎移植慢性排斥反應受者外周血miRNA表達譜存在特征性改變,這些特征性miRNA所調控的靶基因與炎癥、淋巴細胞活化、血管再生、纖維化等過程有關。這可能為臨床尋找診斷慢性排斥反應的生物學標志物及慢性排斥反應相關發(fā)生發(fā)展機制的研究提供參考。
【關鍵詞】：miRNA 腎移植 慢性排斥反應 靶基因 基因芯片
【學位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R699.2
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-19
• 1 病例來源12
• 2 主要儀器設備及試劑12-13
• 2.1 主要試劑12
• 2.2 主要儀器12-13
• 2.3 實驗所需試劑配置及保存13
• 2.4 miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫13
• 3 實驗方法與步驟13-19
• 3.1 血液樣本的收集、處理與保存13
• 3.2 全血總RNA的提取及質量檢測13-14
• 3.3 miRNA芯片雜交14-16
• 3.4 芯片數(shù)據(jù)分析16
• 3.5 實時熒光定量PCR(Taqman探針方法)16-18
• 3.6 靶基因預測18
• 3.7 統(tǒng)計學分析18-19
• 結果19-26
• 1 RNA質量檢測結果19-20
• 2 miRNA雜交芯片質控檢測結果20-21
• 2.1 核心質控檢測20
• 2.2 參考質控標準20
• 2.3 芯片平均信號值與背景信號值20-21
• 2.4 miRNA芯片雜交信號掃描結果21
• 3 miRNA芯片結果21-23
• 4 實時熒光定量PCR結果23-24
• 5 靶基因預測結果24-26
• 討論26-30
• 結論30-31
• 參考文獻31-33
• 附錄33-34
• 致謝34-35
• 文獻綜述35-40
• 參考文獻38-40
• 作者簡歷40

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關鍵詞：移植腎慢性排斥反應外周血miRNA表達譜篩查與靶基因預測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：354115