本文關(guān)鍵詞：移植腎慢性排斥反應(yīng)外周血miRNA表達(dá)譜篩查與靶基因預(yù)測，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腎移植是治療尿毒癥的最佳手段,移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生往往不可避免。隨著移植配型技術(shù)的進(jìn)步以及新型免疫抑制劑的開發(fā)使用,腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率顯著下降,但慢性排斥反應(yīng)仍然嚴(yán)重威脅著移植腎的長期存活。移植腎穿刺活檢是診斷慢性排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn),但穿刺活檢屬于有創(chuàng)檢查,存在一定的并發(fā)癥,增加受者的心理及生理負(fù)擔(dān)。常規(guī)生化檢驗(yàn)與影像學(xué)檢查無法確定是否存在慢性排斥反應(yīng),所以,臨床上迫切需要尋找一種無創(chuàng)的、高敏感性、高特異性的生物學(xué)指標(biāo),能夠?qū)崿F(xiàn)慢性排斥反應(yīng)的無創(chuàng)診斷。微小RNA(microRNA、miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈RNA,具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的功能。miRNA在人體生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡等各種病理生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,人體內(nèi)miRNA表達(dá)量的改變與各種生理和病理狀態(tài)密切相關(guān),比較不同狀態(tài)下miRNA表達(dá)譜可以發(fā)現(xiàn)特征性表達(dá)的miRNA,這既是優(yōu)良的疾病標(biāo)志物,還可用作疾病的防治靶標(biāo)及機(jī)制研究的切入點(diǎn)。目的：1、比較移植腎慢性排斥反應(yīng)與術(shù)后穩(wěn)定恢復(fù)受者外周血miRNA表達(dá)譜的不同,篩選出特征性表達(dá)的miRNA,為實(shí)現(xiàn)慢性排斥反應(yīng)的無創(chuàng)診斷提供參考；2、預(yù)測特征性表達(dá)miRNA所調(diào)控的靶基因,為后續(xù)移植腎慢性排斥反應(yīng)相關(guān)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。方法：選擇3例經(jīng)移植腎穿刺病理明確診斷為“T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)”的受者為實(shí)驗(yàn)組,3例腎移植術(shù)后移植腎穿刺病理診斷無異常的受者為對照組。抽取兩組受者外周靜脈血,提取血液RNA,進(jìn)行純度及完整性檢測、poly(A)加尾、Flash Tag Biotin HSR Ligation標(biāo)記、Affymetrix-miRNA芯片雜交,掃描儀掃描芯片結(jié)果,進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)分析,比較兩組miRNA表達(dá)譜差異,篩選出特征性表達(dá)的miRNA,運(yùn)用TaqMan探針的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗(yàn)證芯片結(jié)果。采用mirecords數(shù)據(jù)庫檢索差異表達(dá)的miRNA調(diào)控的靶基因,初步分析靶基因分布特征。結(jié)果：1、兩組血液樣本總RNA濃度均大于34.9ng/ml,在260nm/280nm的吸收峰值均介于1.8-2.1；甲醛變性凝膠電泳結(jié)果顯示兩組樣本均出現(xiàn)兩條粗亮而濃的條帶,最上面一條28S和下面一條18S,且28S條帶的亮度幾乎為18S的兩倍。表明抽提的RNA純度及完整性較好,質(zhì)量檢測合格,未出現(xiàn)明顯降解及污染等跡象。2、miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果：Affymetrix-miRNA芯片總共檢測了6658種miRNA在兩組之間的表達(dá)差異情況,結(jié)果顯示34種miRNA表達(dá)存在顯著差異(p0.05)；其中12種表達(dá)上調(diào),miR-4423-3p上調(diào)最明顯(7.09倍),上調(diào)表達(dá)的miRNA多定位于1號和2號染色體；22種miRNA表達(dá)下調(diào),miR-3613-5p下調(diào)最明顯(0.08倍),下調(diào)表達(dá)的miRNA多定位于9號和14號染色體。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果：選取miR-4423-3p和miR-133a-3p進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示miR-133a-3p及miR-4423-3p表達(dá)差異倍數(shù)與芯片結(jié)果吻合,說明芯片檢測結(jié)果可靠。4、靶基因查詢顯示差異表達(dá)的34種miRNA共調(diào)控約9003種靶基因表達(dá),這些靶基因部分分布在炎癥反應(yīng)、血管再生、淋巴細(xì)胞活化、細(xì)胞增殖等方面。結(jié)論：腎移植慢性排斥反應(yīng)受者外周血miRNA表達(dá)譜存在特征性改變,這些特征性miRNA所調(diào)控的靶基因與炎癥、淋巴細(xì)胞活化、血管再生、纖維化等過程有關(guān)。這可能為臨床尋找診斷慢性排斥反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志物及慢性排斥反應(yīng)相關(guān)發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供參考。
【關(guān)鍵詞】：miRNA 腎移植 慢性排斥反應(yīng) 靶基因 基因芯片
【學(xué)位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R699.2
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-19
• 1 病例來源12
• 2 主要儀器設(shè)備及試劑12-13
• 2.1 主要試劑12
• 2.2 主要儀器12-13
• 2.3 實(shí)驗(yàn)所需試劑配置及保存13
• 2.4 miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫13
• 3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟13-19
• 3.1 血液樣本的收集、處理與保存13
• 3.2 全血總RNA的提取及質(zhì)量檢測13-14
• 3.3 miRNA芯片雜交14-16
• 3.4 芯片數(shù)據(jù)分析16
• 3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Taqman探針方法)16-18
• 3.6 靶基因預(yù)測18
• 3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析18-19
• 結(jié)果19-26
• 1 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果19-20
• 2 miRNA雜交芯片質(zhì)控檢測結(jié)果20-21
• 2.1 核心質(zhì)控檢測20
• 2.2 參考質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)20
• 2.3 芯片平均信號值與背景信號值20-21
• 2.4 miRNA芯片雜交信號掃描結(jié)果21
• 3 miRNA芯片結(jié)果21-23
• 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果23-24
• 5 靶基因預(yù)測結(jié)果24-26
• 討論26-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-33
• 附錄33-34
• 致謝34-35
• 文獻(xiàn)綜述35-40
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 作者簡歷40

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：移植腎慢性排斥反應(yīng)外周血miRNA表達(dá)譜篩查與靶基因預(yù)測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：354115