目的應(yīng)用SB431542及Roscovitine處理高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞,觀察抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1通路對(duì)高糖培養(yǎng)足細(xì)胞中Cdk5/p35表達(dá)的影響及抑制Cdk5激酶活性對(duì)高糖和TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響。方法采用不同濃度SB431542（0.1,1.0,10μmol/L）處理高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞,Western印跡法及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各處理組Cdk5及p35蛋白和mRNA的表達(dá)變化情況。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Roscovitine對(duì)高糖及TGF-β1刺激足細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果高糖（HG組）Cdk5和p35的蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯增高,顯著高于正常血糖組（NG）組和甘露醇組（M組）（P<0.05）,并且呈時(shí)間依賴性升高。加入SB431542后,高糖培養(yǎng)導(dǎo)致的足細(xì)胞內(nèi)Smad-2蛋白磷酸化水平明顯降低。同時(shí),HG+SB431542組足細(xì)胞內(nèi)Cdk5和p35的蛋白及mRNA表達(dá)水平呈濃度依賴性顯著降低,明顯低于HG組（P<0.05）。加入Roscovitine后,高糖及TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞的足細(xì)胞凋亡水平顯著下降（P<0.05）。結(jié)論高糖可能通過活化TGF-... 

【文章來源】：中國(guó)老年學(xué)雜志. 2016,36(08)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

Western印跡法檢測(cè)各組足細(xì)胞中Cdk5/p35蛋白的表達(dá)

.03±1.59)%〕，明顯高于NG組〔(5.53±0.81)%，P＜0.05〕，而應(yīng)用Ｒoscovitine后，HG+ＲOS組和TGF-β1+ＲOS組足細(xì)胞的凋亡率出現(xiàn)降低〔(14.65±1.57)%和(17.24±1.05)%〕，顯著低于高糖和TGF-β1培養(yǎng)的細(xì)胞(P＜0.05)。見表3～表5。表2SB431542對(duì)高糖刺激足細(xì)胞中Cdk5/p35蛋白表達(dá)的影響(n=3，OD值，x±s)組別Cdk5p35NG組0．24±0．050．23±0．13HG3h組0．61±0．241)0．56±0．061)HG6h組0．88±0．221)0．77±0．181)HG12h組1．14±0．161)1．09±0．111)與NG組比較:1)P＜0．05，表3同圖2Western印跡檢測(cè)不同濃度SB431542處理高糖培養(yǎng)足細(xì)胞后Cdk5/p35蛋白的表達(dá)表3Cdk5/p35mＲNA在各組足細(xì)胞中的表達(dá)(n=3，x±s)組別Cdk5p35NG組1．00±0．231．00±0．11HG3h組2．12±0．251)4．56±0．541)HG6h組5．79±0．581)7．33±1．061)HG12h組9．66±0．931)12．7±1．371)表4Cdk5/p35、p-Smad-2蛋白在各組足細(xì)胞中的表達(dá)(n=3，OD值，x±s)組別Cdk5p35p-Smad-2NG組0．43±0．080．27±0．060．21±0．08HG組0．83±0．110．71±0．050．62±0．03HG+SB431542(0．1μmol/L)組0．49±0．081)2)0．41±0．081)2)0．37±0．111)2)HG+SB431542(1．0μmol/L)組0．34±0．071)2)0．21±0．041)2)0．16±0．061)2)HG+SB431542(10μmol/L)組0．11±0．051)2)0．07±0．031)2)0．04±0．021)2)與NG組比較:1)P＜0．05;與HG組比較:2)P＜0．05，下表同·1796·中國(guó)老年學(xué)雜志2016年4月第36卷

樣緩沖液，500μl/管(按1∶4用MilliQ水/滅菌蒸餾水稀釋)，反復(fù)吹打均勻;分別加入5μlFITC標(biāo)記的AnnexinV和5μlPI，混勻后避光室溫孵育10min，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行方差分析。2結(jié)果2.1高糖對(duì)足細(xì)胞中Cdk5/p35表達(dá)的影響Western印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，HG組足細(xì)胞內(nèi)Cdk5和p35的蛋白表達(dá)水平在高糖培養(yǎng)后有顯著增高，明顯高于NG組和M組(P＜0.05，圖1)，并且隨高糖培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高(圖1)。ＲT-PCＲ檢測(cè)結(jié)果顯示，Cdk5和p35的mＲNA表達(dá)水平在HG組呈時(shí)間依賴性顯著升高(表1)。圖1Western印跡法檢測(cè)各組足細(xì)胞中Cdk5/p35蛋白的表達(dá)表1高糖對(duì)足細(xì)胞中Cdk5/p35蛋白表達(dá)的影響(n=3，OD值，x±s)組別Cdk5p35NG組0．27±0．020．25±0．03M組0．24±0．030．23±0．05HG組1．28±0．191)2)1．12±0．141)2)與NG組比較:1)P＜0．05;與M組比較:2)P＜0．052.2SB431542對(duì)高糖刺激足細(xì)胞中Cdk5/p35表達(dá)的影響Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，應(yīng)用SB431542后，HG+SB431542組足細(xì)胞中phospho-Smad-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖2)，提示高糖刺激引起的TGF-β1通路活化被抑制。應(yīng)用SB431542后，HG+SB431542組足細(xì)胞中Cdk5和p35的蛋白表達(dá)水平有明顯降低，顯著低于NG組和HG組(P＜0.05)，并與SB431542的濃度密切相關(guān)，呈濃度依賴性降低，10μmol/LSB431542的抑制效果最顯著(圖2)。定量PCＲ的檢測(cè)結(jié)果顯示，HG+SB431542組足細(xì)胞內(nèi)Cdk5和p35的mＲNA表達(dá)水平同SB431542的濃度密切相關(guān)，呈濃度依賴性降低，顯著低于NG組和HG組(P＜0.05，表2)。2.3抑制Cdk5激酶活性對(duì)高糖及TGF-β1刺激足細(xì)胞凋亡的影響高糖和TGF-β1培養(yǎng)足細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率顯著升高〔(20.01±1.72)%和(22.03±1.59)%〕，明顯高于NG組〔(5.5

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Cdk5抑制劑Roscovitine對(duì)糖尿病大鼠腎功能及nestin表達(dá)的影響[J]. 張悅,周毅,張怡,劉巍.  中國(guó)藥理學(xué)通報(bào). 2013(08)



本文編號(hào)：3285350