ARNO/Arf6信號通路在AGEs致腎小球內(nèi)皮高通透性的作用及機制研究
發(fā)布時間：2021-02-17 22:53
背景和目的:糖尿病早期內(nèi)皮/腎小球高通透性（Endothelial/glomerular hyperpermeability）是早期糖尿病腎病（Diabetic nephropathies,DN）重要的病理生理改變,可是我們對其發(fā)生機制仍然一籌莫展。已經(jīng)知道高糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products,AGEs）、內(nèi)皮源性一氧化氮（NO）產(chǎn)生減少、炎癥及氧化應(yīng)激等多種因素可促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,但這些因素最終是通過改變內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能實現(xiàn)的,因此有必要研究內(nèi)皮屏障穩(wěn)定調(diào)控的關(guān)鍵機制,才能找到DN的治療靶點。ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factors,ARFs）是真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)且高度保守的GTP結(jié)合蛋白,是Ras超家族成員之一。Arf6作為ARFs一種特殊亞型,定位于質(zhì)膜和內(nèi)涵體膜上。與其它小分子GTP結(jié)合蛋白一樣,Arf6在有活性的GTP和無活性的GDP兩種結(jié)合構(gòu)象之間轉(zhuǎn)換,其中Arf6-GDP到Arf6-GTP的轉(zhuǎn)換需要鳥苷交換因子（guanine nucleotide exchange factors...
【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市
【文章頁數(shù)】：65 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
濃度依賴實驗中AGEs對HRGECs細(xì)胞活力、ARNOmRNA轉(zhuǎn)錄及protein表達(dá)、Arf6活性和內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響：*P<0.05，**P<0.01
陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文221.2.2時間依賴實驗中AGEs對HRGECs中ARNO/Arf6信號通路及通透性的影響CCK8檢測結(jié)果顯示，各組吸光度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1-2A)，但AGEs48h組HRGECs吸光度均值相對偏低，光鏡下觀察細(xì)胞生長速度偏慢，漂浮細(xì)胞量偏多，提示AGEs刺激時間≥48h時可能對HRGECs生長狀態(tài)產(chǎn)生影響。Real-timePCR及Westernblotting結(jié)果顯示，與AGEs對照組相比，AGEs顯著增加HRGECsARNOmRNA轉(zhuǎn)錄和protein表達(dá)(P<0.05，圖1-2B、C、D)，該作用呈時間依賴性。與AGEs對照組相比，ARNO表達(dá)最高的AGEs48h組，蛋白表達(dá)量約為3.4倍。pulldownassay及FITC-Dextran(40kDa)檢測結(jié)果顯示，AGEs也時間依賴性增加HRGECsArf6活性和內(nèi)皮細(xì)胞通透性(P<0.05，圖1-2C、E、F)，該作用趨勢與ARNO表達(dá)趨勢一致。圖1-2時間依賴實驗中AGEs對HRGECs細(xì)胞活力、ARNOmRNA及protein表達(dá)、Arf6活性和內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響：*P<0.05，**P<0.01。Control：AGEs對照組。根據(jù)以上時間和濃度依賴實驗結(jié)果，80μg/mlAGEs刺激24h時，HRGECsARNO/Arf6信號活化和內(nèi)皮通透性改變顯著，細(xì)胞活力也影響較小，故我們選擇80μg/mlAGEs刺激24h作為后續(xù)的AGEs刺激條件。1.2.360min以內(nèi)高糖對HRGECs中ARNO表達(dá)及通透性的影響60min以內(nèi)高糖時間依賴實驗中，Westernblotting檢測結(jié)果顯示，與高糖對照組相比，高糖顯著增加HRGECsARNO表達(dá)(P<0.05，圖1-3A、B)，30min達(dá)到最高，45min后出現(xiàn)回落。與高糖對照組相比，ARNO表達(dá)最高的高糖30min組，蛋白表達(dá)
陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文23量在4倍以上。FITC-Dextran(40kDa)檢測結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞通透性與ARNO表達(dá)時間趨勢一致(圖1-3C)。甘露醇組與高糖對照組ARNO表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。選用30min為60min以內(nèi)高糖濃度依賴實驗時相點。Westernblotting檢測結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖顯著增加HRGECsARNO表達(dá)(P<0.05，圖1-3D、E)，該作用呈濃度依賴性。與正常糖組相比，ARNO表達(dá)最高的高糖40mmol/L組，蛋白表達(dá)量近7倍。FITC-Dextran(40kDa)檢測結(jié)果顯示，高糖也濃度依賴性增加HRGECs通透性(圖1-3F)。甘露醇組與正常糖組ARNO表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖1-360min內(nèi)時間/濃度依賴實驗中高糖對HRGECsARNO表達(dá)及通透性的影響：*P<0.05，**P<0.01。A、B、CControl：高糖對照組。D、E、FControl：正常糖組。1.2.46h以上高糖對HRGECs中ARNO表達(dá)及通透性的影響6h以上高糖濃度依賴實驗中，Westernblotting及FITC-Dextran(40kDa)檢測結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖30mmol/L、40mmol/L組HRGECsARNO表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高(P<0.05，圖1-4A、B、C)，而10mmol/L、20mmol/L組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與正常糖組相比，ARNO表達(dá)最高的高糖40mmol/L組，蛋白表達(dá)量約為1.5倍。甘露醇組與正常糖組ARNO表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。選擇30mmol/L為6h以上高糖時間依賴實驗刺激條件。Westernblotting及
【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]ROBO4/ARF6信號通路在高糖誘導(dǎo)的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的作用研究[D]. 唐璐瑤.第三軍醫(yī)大學(xué) 2017
本文編號：3038665
【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市
【文章頁數(shù)】：65 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
濃度依賴實驗中AGEs對HRGECs細(xì)胞活力、ARNOmRNA轉(zhuǎn)錄及protein表達(dá)、Arf6活性和內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響：*P<0.05，**P<0.01
陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文221.2.2時間依賴實驗中AGEs對HRGECs中ARNO/Arf6信號通路及通透性的影響CCK8檢測結(jié)果顯示，各組吸光度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1-2A)，但AGEs48h組HRGECs吸光度均值相對偏低，光鏡下觀察細(xì)胞生長速度偏慢，漂浮細(xì)胞量偏多，提示AGEs刺激時間≥48h時可能對HRGECs生長狀態(tài)產(chǎn)生影響。Real-timePCR及Westernblotting結(jié)果顯示，與AGEs對照組相比，AGEs顯著增加HRGECsARNOmRNA轉(zhuǎn)錄和protein表達(dá)(P<0.05，圖1-2B、C、D)，該作用呈時間依賴性。與AGEs對照組相比，ARNO表達(dá)最高的AGEs48h組，蛋白表達(dá)量約為3.4倍。pulldownassay及FITC-Dextran(40kDa)檢測結(jié)果顯示，AGEs也時間依賴性增加HRGECsArf6活性和內(nèi)皮細(xì)胞通透性(P<0.05，圖1-2C、E、F)，該作用趨勢與ARNO表達(dá)趨勢一致。圖1-2時間依賴實驗中AGEs對HRGECs細(xì)胞活力、ARNOmRNA及protein表達(dá)、Arf6活性和內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響：*P<0.05，**P<0.01。Control：AGEs對照組。根據(jù)以上時間和濃度依賴實驗結(jié)果，80μg/mlAGEs刺激24h時，HRGECsARNO/Arf6信號活化和內(nèi)皮通透性改變顯著，細(xì)胞活力也影響較小，故我們選擇80μg/mlAGEs刺激24h作為后續(xù)的AGEs刺激條件。1.2.360min以內(nèi)高糖對HRGECs中ARNO表達(dá)及通透性的影響60min以內(nèi)高糖時間依賴實驗中，Westernblotting檢測結(jié)果顯示，與高糖對照組相比，高糖顯著增加HRGECsARNO表達(dá)(P<0.05，圖1-3A、B)，30min達(dá)到最高，45min后出現(xiàn)回落。與高糖對照組相比，ARNO表達(dá)最高的高糖30min組，蛋白表達(dá)
陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文23量在4倍以上。FITC-Dextran(40kDa)檢測結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞通透性與ARNO表達(dá)時間趨勢一致(圖1-3C)。甘露醇組與高糖對照組ARNO表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。選用30min為60min以內(nèi)高糖濃度依賴實驗時相點。Westernblotting檢測結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖顯著增加HRGECsARNO表達(dá)(P<0.05，圖1-3D、E)，該作用呈濃度依賴性。與正常糖組相比，ARNO表達(dá)最高的高糖40mmol/L組，蛋白表達(dá)量近7倍。FITC-Dextran(40kDa)檢測結(jié)果顯示，高糖也濃度依賴性增加HRGECs通透性(圖1-3F)。甘露醇組與正常糖組ARNO表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖1-360min內(nèi)時間/濃度依賴實驗中高糖對HRGECsARNO表達(dá)及通透性的影響：*P<0.05，**P<0.01。A、B、CControl：高糖對照組。D、E、FControl：正常糖組。1.2.46h以上高糖對HRGECs中ARNO表達(dá)及通透性的影響6h以上高糖濃度依賴實驗中，Westernblotting及FITC-Dextran(40kDa)檢測結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖30mmol/L、40mmol/L組HRGECsARNO表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高(P<0.05，圖1-4A、B、C)，而10mmol/L、20mmol/L組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與正常糖組相比，ARNO表達(dá)最高的高糖40mmol/L組，蛋白表達(dá)量約為1.5倍。甘露醇組與正常糖組ARNO表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。選擇30mmol/L為6h以上高糖時間依賴實驗刺激條件。Westernblotting及
【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]ROBO4/ARF6信號通路在高糖誘導(dǎo)的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的作用研究[D]. 唐璐瑤.第三軍醫(yī)大學(xué) 2017
本文編號：3038665
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