目的:分析不同惡性程度膀胱癌組織中RAB14的表達水平,并探究其表達水平與膀胱癌臨床分期、分化程度、有無遠處轉移等臨床病理因素之間的相關性。采用基因芯片高通量篩選RAB14表達干擾后膀胱癌細胞的基因表達變化,預測RAB14下游的關鍵互作基因及分子機制。通過免疫組化和western blot等方法檢測及驗證RAB14表達下調后其下游關鍵基因及分子的蛋白翻譯水平變化,探究RAB14在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機制。方法:收集2013年1月至2018年12月于我院行全膀胱根治性術的膀胱癌組織標本80例及正常膀胱組織30例;采用免疫組化法檢測RAB14在膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達,分析其表達水平與胱癌臨床分期、分化程度、有無遠處轉移等臨床病理因素之間的關系;體外培養(yǎng)不同的膀胱癌細胞株,采用qRT-PCR檢測RAB14基因在各細胞中的表達水平,分析其表達差異。采用慢病毒技術構建RAB14表達干擾的細胞模型,采用高通量基因表達譜芯片技術篩選RAB14表達變化后膀胱癌細胞中基因表達的變化,預測RAB14的下游關鍵互作基因及分子機制。通過免疫組化法檢測上述基因芯片高通量篩選的MAPK通路相關蛋白MAPK1的表達,分析其表達與RAB14的相關性;在構建RAB14干擾的細胞模型基礎上,采用Western blot檢測RAB14表達改變對MAPK通路相關蛋白MAPK1、MAPK8、DUSP6、FOS及SHC1的表達的影響。結果:1.膀胱癌組織中RAB14基因的表達水平要高于正常的膀胱黏膜,差異顯著(P=0.0128),且侵襲性膀胱癌組織中RAB14的表達水平要明顯高于非侵襲性膀胱癌組織,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);RAB14表達水平與膀胱癌的有無淋巴結轉移(P=0.001)、臨床TNM分期(P=0.009)、腫瘤細胞分化程度(P=0.000)呈正相關。qRT-PCR檢測結果表明,與J82低轉移潛能細胞相比,RAB14在高轉移潛能的膀胱癌細胞株5637和T24中的表達明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。2.qRT-PCR檢測KD組RAB14基因敲減效率相比NC組達到53.3%,RAB14敲減效果佳。PCA分析KD組和NC組之間差異較大,提示樣本質量較好�；蛐酒Y果顯示RAB14表達下調后,膀胱癌細胞5637中表達上調的基因共有498個,表達下調的基因有551個,GO富集分析差異表達基因的生物學途徑(Biological process)主要富集在細胞凋亡的正負調控及細胞遷移上;細胞內組分(Cellular components)主要富集在胞外外泌體、細胞質基質及細胞質中;分子功能(Molecular function)主要體現(xiàn)在具有調節(jié)GTP酶活性、與蛋白質結合、與表皮生長因子受體結合及具有激酶活性等生物學功能。KEGG通路分析顯示其差異表達基因主要富集在MAPK signaling pathway、Pathways in cancer、Pertussis、FoxO signaling pathway等信號通路上。3.免疫組化結果表明膀胱癌組織中MAPK1染色呈強陽性,其表達趨勢與RAB14表達趨勢正相關,即在癌組織中RAB14低表達時,MAPK1表達強度亦偏弱,在RAB14高表達的膀胱癌組織中MAPK1的表達強度則偏強;Western blot結果表明RAB14表達被干擾后,膀胱癌細胞中MAPK1和MAPK8的蛋白表達水平明顯降低,而DUSP6,FOS及SHC1的蛋白表達水平則明顯升高。結論:1.RAB14是一個與膀胱癌關系密切的基因,其在其癌組織及癌細胞中呈較高表達水平,且其表達水平與膀胱癌臨床分期、腫瘤細胞分化程度及有無遠處轉移等臨床病理因素呈正相關;2.基因芯片高通量數(shù)據(jù)顯示,RAB14干擾表達后,影響多個基因的表達改變和多條信號通路傳導被激活或被抑制,其中ERK/MAPK信號通路被顯著抑制;3.RAB14通過上調MAPK1和MAPK8的表達并下調DUSP6、FOS和SHC1的表達,從而促進膀胱癌細胞的進展。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R737.14
【部分圖文】：

第 2 章 免疫組化及 qPCR 技術檢測膀胱癌組織及細胞中 RAB14 的表達StainingindexofRAB1401 02 03 0N o rm a l C a n c e r*P = 0 .0 1 2 8圖 1-1. 分析不同的膀胱癌組織中及正常組織中 RAB14 蛋白的表達情況

圖 1-3. 分析不同惡性程度的膀胱癌細胞中 RAB14 基因的表達差異ab 蛋白屬于小 GTP 酶蛋白質超家族的一員，其分子質量約為 20~3功能是參與調控細胞膜運輸?shù)哪遗菪纬�、囊泡形成轉運及膜的融學過程[33]。研究發(fā)現(xiàn) Rab 蛋白家族與腫瘤關系密切，其可調控腫質傳遞和信號轉運，在腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移等生物學過鍵調控因子的角色[34]。Gong 等[35]學者研究發(fā)現(xiàn)，RAB18 在肝癌中異常高表達，癌組織中 RAB18 高表達的患者總體生存率低，R患者生存率相對較高，即 RAB18 越高，肝癌患者預后越差；體外過干擾肝癌細胞 RAB18 的表達后，肝癌細胞的克隆形成、增殖率遷移及侵襲能力明顯減弱。提示 RAB18 基因表達與肝癌患者的預其表達水平高則患者預后不良，并可提高肝癌細胞的增殖率和促快了肝癌進展。Liu 等[36]學者報道，采用轉染技術上調乳腺癌細胞A-MB-231 中 RAB9 表達后，細胞凋亡率明顯下降，細胞的存活延

第 3 章 基因芯片技術分析 RAB14 干擾后下游基因表達譜的改變及對相關信號通路的影響2 結果2.1 膀胱癌細胞 5637 慢病毒轉染效率及 qRT-PCR 驗證通過采用慢病毒轉染技術干擾 5637 細胞中 RAB14 的表達，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)NC組與KD組轉染效果達90%以上，轉染效果好（圖2-1A）；進一步qRT-PCR驗證 RAB14 干擾慢病毒轉染效率，結果發(fā)現(xiàn)，與 NC 組相比，KD 組中 RAB14基因敲減效率達到 53.3%，說明 RAB14 敲減效果佳，符合預期（圖 2-1B）。
【參考文獻】

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本文編號：2862593