睪丸生殖細(xì)胞腫瘤(testicular germ cell tumor,TGCT)是一類發(fā)生于睪丸或睪丸附近的腫瘤,近年來發(fā)病率有所增加,受到廣泛關(guān)注。TGCTs的形成與睪丸先天性發(fā)育不良、遺傳因素、某些基因突變以及信號通路異常有關(guān)。目前對其發(fā)病機制的了解還非常有限。microRNA-199a-3p(miR-199a-3p)是本課題組前期在GC-1 spg細(xì)胞中篩選得到的受TGF-β1調(diào)節(jié)的mi RNA分子,參與男性生殖發(fā)育。已有研究表明,miR-199a-3p在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用。為了探討miR-199a-3p在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的功能及調(diào)控機制,本論文開展了以下幾個方面的工作:1.探討了miR-199a-3p在睪丸腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)以人睪丸畸胎瘤瘤細(xì)胞Ntera-2和小鼠精原上皮細(xì)胞GC-1 spg為研究材料,通過MTT、劃痕及流式細(xì)胞實驗檢測了miR-199a-3p對細(xì)胞的增殖能力、遷移能力、細(xì)胞周期及凋亡的影響。結(jié)果表明miR-199a-3p可以抑制Ntera-2和GC-1 spg細(xì)胞的增殖、遷移,但不影響細(xì)胞凋亡。此外,在Ntera-2細(xì)胞中我們觀察到了mi R-199a-3p對細(xì)胞周期阻滯的現(xiàn)象。以上結(jié)果提示miR-199a-3p在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中發(fā)揮抑制因子作用。2.發(fā)現(xiàn)了miR-199a-3p靶向調(diào)控Nme2基因的表達Nme2基因是一個腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子,與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報告基因檢測及定量PCR實驗,我們發(fā)現(xiàn):miR-199a-3p靶向識別Nme2基因的3'UTR序列;對miR-199a-3p的抑制能明顯下調(diào)Nme2的表達。3.初步證實了miR-199a-3p及Nme2在TGF-β通路中的作用相互關(guān)聯(lián)利用TGF-β1處理GC-1 spg細(xì)胞后,結(jié)果顯示Nme2和miR-199a-3p在mRNA水平的表達均隨TGF-β1濃度升高而上調(diào);進一步利用miR-199a-3p和TGF-β1雙重作用于GC-1 spg后,結(jié)果顯示Nme2的表達會顯著上調(diào)。已有研究表明,Nme2在TGF-β通路中發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。我們推測在TGF-β1通路中,mi R-199a-3p被抑制的部分功能可能會被Nme2補償。4.探討了mi R-199a-3p對Ntera-2細(xì)胞代謝的影響生化分析結(jié)果表明,在Ntera-2細(xì)胞中,抑制mi R-199a-3p后,其乳酸含量顯著提升,表明miR-199a-3p影響Ntera-2細(xì)胞的代謝過程。在此基礎(chǔ)上,進一步利用qPCR array技術(shù)篩選獲得了12個受miR-199a-3p調(diào)控的代謝基因,其中上調(diào)基因2個,下調(diào)基因10個。5.在臨床睪丸腫瘤標(biāo)本中驗證了mi R-199a-3p與其調(diào)控的代謝基因的關(guān)系我們首先利用GEO數(shù)據(jù)庫分析了不同的正常組織及其相應(yīng)的腫瘤組織中miR-199a-3p的表達豐度,結(jié)果顯示miR-199a-3p的表達具有組織特異性,在不同組織中分別發(fā)揮抑癌或促癌作用,其中在人類TGCT組織中發(fā)揮抑癌作用。對臨床睪丸腫瘤標(biāo)本的定量PCR分析結(jié)果表明,miR-199a-3p在睪丸腫瘤中表達下調(diào),表明其的確發(fā)揮抑癌作用。進一步分析發(fā)現(xiàn),在12個受miR-199a-3p調(diào)控的代謝基因中,其中有4個基因(LDHA,MCT1,PGK1和TIGAR)的表達與miR-199a-3p在臨床睪丸腫瘤標(biāo)本中的表達相反,這與它們在Ntera-2細(xì)胞中存在互反關(guān)系的結(jié)果一致,表明LDHA,MCT1,PGK1和TIGAR很可能為miR-199a-3p在代謝通路中的靶基因。綜上,本論文明確了miR-199a-3p在睪丸腫瘤中發(fā)揮抑癌作用;確定了mi R-199a-3p靶向調(diào)控Nme2的表達;初步證實miR-199a-3p與Nme2在TGF-β通路中的作用相互關(guān)聯(lián);發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p參與了腫瘤的糖代謝過程,并篩選獲得12個受miR-199a-3p調(diào)控的代謝相關(guān)基因,其中LDHA、MCT1、PGK1和TIGAR可能為其潛在的靶基因。由此,我們認(rèn)為miR-199a-3p可通過不同途徑在男性生殖細(xì)胞腫瘤中發(fā)揮抑癌作用,可能是睪丸腫瘤預(yù)后和治療的潛在生物標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R737.2
【部分圖文】：

長分化因子( GDF)等[62]。其信號通路的基因多效性、信號協(xié)調(diào)性和依賴性在細(xì)胞的增殖遷移、分泌、分化，以及胚胎發(fā)育、胞外基質(zhì)形成、骨的形成和重建等方面發(fā)揮作用，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β/smads 信號通路是一個精密的信號級聯(lián)反應(yīng)通路，其參與分子或信號傳遞紊亂，都可致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程異常，進而影響 TGF-β 調(diào)控的生物學(xué)活動。Smad 蛋白家族作為 TGF-β 信號通路的關(guān)鍵一員，與 TGF-β 共同形成經(jīng)典的 TGF-β/smad 信號通路，從而調(diào)控復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。目前已知 9 種 Smad 蛋白，以其結(jié)構(gòu)和效應(yīng)分為 3 個子類：①Smadl、2、3、5、8、9 屬于受體激活型 Smad (receptor-activated Smad,R-Smad)。其中Smad2、3 可直接被 TGF-β 激活，成為 TpRI 激酶的底物，從而被磷酸化；②Smad4 能與 活 化 的 Smad 形 成 異 源 多 聚 體 ， 其 為 哺 乳 動 物 中 僅 有 的 通 用 型 Sma(common-partnerSmad,Co-Smad)，其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起瓶頸作用，輔助活化蛋白進入細(xì)胞核，將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)致胞內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[63]；③Smad6、7 等屬于抑制型Smad(inhibitory Smad，I-Smad)，主要作用是阻斷 R-Smad 磷酸化、與磷酸化的受體或受體激活的 Smads 競爭性結(jié)合，抑制異源多聚體的活性、阻礙磷酸化的 R-Smad 與 Co-Sma異源多聚體形成等，從而對 TGF-β/smad 信號產(chǎn)生抑制作用。

MiR-199a-3p 在男性生殖細(xì)胞腫瘤中的抑癌作用研究進行 Poly(A)加尾處理。TaKaRa 公司的 miRNA PrimeScript RT Enzyme M(A) Polymerase 和反轉(zhuǎn)錄酶 PrimeScript RTase，可將 miRNA 加尾后隨即逆在此過程中，還引入了 Uni-miR qPCR Primer 的結(jié)合位點，可以利用這一任何 cDNA 進行定量 PCR 反應(yīng)。原理圖如下（圖 1.1）：

圖 2.2 qPCR 檢測 miR-199a-3p 合成物的轉(zhuǎn)染效率2.3.2 miR-199a-3p對Ntera-2和GC-1 spg細(xì)胞增殖的影響以 Ntera-2 和 GC-1 spg 細(xì)胞作為實驗?zāi)Ｐ�，利�?MTT 實驗，檢測 miR-199a-3p 對Ntera-2 和 GC-1spg 細(xì)胞的增殖能力的影響。圖 2.3 表示 miR-199a-3p mimics 以及miR-199a-3p inhibitor 分別轉(zhuǎn)染 0 h，24 h 和 72 h 后 Ntera-2 細(xì)胞（a）和 GC-1 spg 細(xì)胞（b）的存活率。從圖中可以看出，在 24 h 內(nèi)，無論 Ntera-2 還是 GC-1 spg 細(xì)胞，相比于 NC 對照組，miR-199a-3p mimics 轉(zhuǎn)染組或 miR-199a-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞的存活率變化均無顯著性差異。但在 72 h 后，轉(zhuǎn)染了 miR-199a-3p mimics 組的細(xì)胞存活率明顯下降，表明 miR-199a-3p 抑制了 Ntera-2 和 GC-1 spg 細(xì)胞的生長。
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本文編號：2853144