目的:慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)病人較常見的心血管并發(fā)癥是血管鈣化,然而血管鈣化又是CKD患者發(fā)生心血管事件的重要危險(xiǎn)因素之一。最近研究表明,血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化是CKD血管鈣化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。長鏈非編碼RNA(lncRNA)H19在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。LncRNA H19是否參與血管鈣化的調(diào)控?分子機(jī)制是什么?目前尚不清楚。因此本研究旨在探討LncRNA H19在VSMC鈣化中的發(fā)揮的作用及其可能機(jī)制。方法:1.采用體外移植組織塊培養(yǎng)原代VSMCs;高磷刺激VSMCs誘導(dǎo)鈣化。將VSMCs隨機(jī)分為4組:正常對照組、高磷組、高磷+shRNA H19組、高磷+shRNA對照組。2.高磷刺激VSMCs 7d、14d后,檢測ALP活性、茜素紅染色及鈣含量。3.采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法檢測LncRNA H19、miR-103、miR-675、mRNA Runx2、mRNA BMP-2的表達(dá)。4.采用Western blotting檢測Runx2、BMP-2蛋白的表達(dá)。5.統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件。單因素方差分析(ANOVA)應(yīng)用于組間比較,SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗(yàn)應(yīng)用于組內(nèi)兩兩比較,認(rèn)為P0.05時(shí),差異是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。結(jié)果:1.高磷誘導(dǎo)VSMCs的鈣化情況茜素紅染色結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高磷刺激7天、14天組可見大量橘紅色鈣鹽沉積,且14天較7天明顯。鈣含量測定結(jié)果顯示,高磷刺激7天、14天組鈣含量增加,且14天較7天明顯(P0.001)。2.高磷誘導(dǎo)的VSMCs ALP活性、及Runx2、BMP-2表達(dá)情況ALP活性檢測結(jié)果示,與正常對照組相比,高磷刺激7天、14天組ALP活性增加,且14天較7天明顯(P0.001)。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果示,各組VSMCs培養(yǎng)7天、14天后,與正常對照組相比,高磷組Runx2、BMP-2的表達(dá)水平明顯升高,且14天較7天明顯(P0.05)。與高磷組相比,高磷+shRNA H19組Runx2、BMP-2的表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。3.高磷誘導(dǎo)的VSMCs LncRNA H19、miR-103、miR-675的表達(dá)情況實(shí)時(shí)熒光-PCR結(jié)果顯示,與正常血管平滑肌細(xì)胞對比,高磷刺激VSMCs后,LncRNA H19、miR-675的水平明顯升高,且高磷刺激14天較7天的明顯(P0.05);高磷組miR-103的表達(dá)水平明顯降低,且14天較7天明顯(P0.05)。與高磷組相比,高磷+shRNA H19組LncRNA H19、miR-675的表達(dá)水平明顯降低,miR-103的表達(dá)水平升高(P0.05)。結(jié)論:1.在高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化過程中,LncRNA H19、miR-675的表達(dá)水平升高,miR-103的表達(dá)水平下降。2.高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化,可能由LncRNA H19/miR-103/Runx2軸調(diào)控。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

圖 1 各組大鼠 VSMCs 鈣化染色情況(茜素紅染色，×100)注：A：正常對照組 B：高磷刺激 7d 組 C：高磷刺激 14d 組Fig.1 Results of calcification staining in VSMCs(Alizarin red staining，×1#A: Normal control B: High phosphorus stimulation for7days C: Highphosphorus stimulation for 14 days表 1 各組大鼠 VSMCs 鈣含量的比較（ x 士 s）Table 1 The content of calcium in rat VSMCs（ x 士 s）分組 VSMCs 鈣含量（mg/g）正常對照組 20.94±1.28高磷 7d 組 62.11±3.84高磷 14d 組 112.9±15.012. 高磷刺激促進(jìn) VSMCs 發(fā)生表型轉(zhuǎn)化

明顯(P<0.001)（表 2）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，各組 VSMCs 培養(yǎng) 7 天、14天后，與正常對照組相比，高磷組 mRNA Runx2、mRNA BMP-2 的表達(dá)水平明顯升高，且干預(yù)14天mRNA升高較7天明顯(P<0.05)(圖2)。WesternBlot 結(jié)果顯示，各組 VSMCs 培養(yǎng) 7 天、14 天后，與正常對照組相比，高磷組 Runx2、BMP-2 蛋白的表達(dá)水平明顯升高，且干預(yù) 14 天蛋白較 7 天升高明顯(P<0.05)(圖 3)。上述結(jié)果表明，高磷刺激大鼠的血管平滑肌細(xì)胞，A BC

2 各組大鼠 VSMCs mRNARunx2、mRNABMP-2 的表達(dá)情況MCs mRNARunx2的表達(dá)情況 ②VSMCs mRNABMP-2的表達(dá)情A：正常對照組 B：高磷刺激 7d 組 C：高磷刺激 14d 組；*P< 0.05,*< 0.01,***P<0.001g.2 Expression of mRNARunx2 and mRNABMP-2 in VSMCs of ratsxpression of mRNARunx2 in VSMCs.②Expression of mRNABMP-2 VSMCsA: Normal control B: High phosphorus stimulation for7days C: Highphosphorus stimulation for 14 days;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001unx2 BMP-2β-GP β-GP
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本文編號：2840089