前言慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)威脅著全世界的公共健康,發(fā)病率逐年遞增,且呈年輕化趨勢。研究證實(shí)大部分CKD進(jìn)展至腎衰竭的共同通路是腎小管-間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF),目前對RIF的發(fā)病機(jī)制尚不明確,對其發(fā)生、發(fā)展過程尚缺乏全面而深刻的認(rèn)識。既往研究表明,在RIF的發(fā)生、發(fā)展過程中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)起到了至關(guān)重要的作用。腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,是指當(dāng)腎臟遭受到局部激活或損傷后,腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及特征的過程。參與EMT的調(diào)節(jié)因子有很多,其中公認(rèn)的最重要的促纖維化因子是轉(zhuǎn)化生長因子-beta(TGF-β)。TGF-β介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路錯(cuò)綜復(fù)雜,主要包括Smad依賴性和Smad非依賴性信號通路(例如ERK/MAPK,PI3K/AKT,Rho A,JNK/p38等等)。本文研究的細(xì)胞因子FAM3C又被稱為白介素樣的EMT誘導(dǎo)因子(interleukin-like epithelial-mesenchymal transition inducer,ILEI)是2002年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子樣基因家族FAM的成員,FAM家族由FAM3A、FAM3B、FAM3C和FAM3D 4個(gè)成員組成。近期研究發(fā)現(xiàn)ILEI參與了癌癥的進(jìn)展過程,以及EMT的發(fā)生。在乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中,ILEI表達(dá)及分泌明顯增加。并認(rèn)為ILEI是TGF-β的下游因子,沉默ILEI能減弱TGF-β促進(jìn)EMT發(fā)生的作用。目前,關(guān)于ILEI與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化之間關(guān)系的研究尚沒有相關(guān)報(bào)道,我們以人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)為體外模型,探討ILEI在腎小管發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化時(shí)的變化以及ILEI對TGF-β誘導(dǎo)的腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的具體作用及機(jī)制。第一部分ILEI與腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化之間的關(guān)系研究目的:觀察TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化時(shí)的相關(guān)變化,探討ILEI在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中表達(dá)的變化。方法:常規(guī)培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞),不同劑量的TGF-β1(0、l、2、5及10ng/ml)作用于HK-2細(xì)胞48小時(shí)或5ng/ml濃度的TGF-β1作用于HK-2細(xì)胞不同時(shí)間(0、12、24、48及72小時(shí)),使用相差顯微鏡下觀察各組HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,Western blot、RT-PCR及免疫熒光檢測各組HK-2細(xì)胞的ILEI、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及波形蛋白(Vimentin)的蛋白及m RNA的表達(dá)。此外應(yīng)用Transwell小室法檢測HK-2細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果:(1)TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞后,其細(xì)胞形態(tài)向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,細(xì)胞與細(xì)胞的間距明顯增大,細(xì)胞形態(tài)變大、變梭。(2)TGF-β1以時(shí)間依賴的方式下調(diào)HK-2細(xì)胞E-cadherin的蛋白及m RNA表達(dá),上調(diào)α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA表達(dá)。(3)ILEI在HK-2細(xì)胞中有少量表達(dá),在TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)表達(dá)增加,且TGF-β1以時(shí)間及劑量依賴的方式上調(diào)HK-2細(xì)胞ILEI的蛋白和m RNA表達(dá)。(4)隨著TGF-β1作用時(shí)間的延長,HK-2細(xì)胞的遷移能力逐漸增強(qiáng)。結(jié)論:(1)TGF-β1能夠誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT,與E-cadherin、α-SMA及Vimentin存在時(shí)間依賴性,且TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞后能增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。(2)ILEI參與了腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,其表達(dá)水平與TGF-β1存在時(shí)間和濃度依賴性。第二部分ILEI在TGF-β誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用機(jī)制研究目的:探討ILEI在TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中所發(fā)揮的作用及其機(jī)制。方法:根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異引物,擴(kuò)增ILEI基因片段,使用pc DNA 3.1+質(zhì)粒進(jìn)行ILEI表達(dá)載體的構(gòu)建,使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。ILEI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72h后,Western blot及RT-PCR檢測正常組、空載體轉(zhuǎn)染組、ILEI轉(zhuǎn)染組E-cadherin,α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA表達(dá),使用Transwell小室法檢測各組HK-2細(xì)胞遷移能力的變化。在ILEI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后,給予5ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)48h,相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,Western blot及RT-PCR檢測經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的正常組、空載體轉(zhuǎn)染組、ILEI轉(zhuǎn)染組的E-cadherin,α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA表達(dá),使用Transwell小室法檢測各組HK-2細(xì)胞遷移能力的變化。另外,用脂質(zhì)體2000將人ILEI靶向性si RNA轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞。相差顯微鏡觀察正常組、TGF-β1誘導(dǎo)組、ILEI si RNA+TGF-β1誘導(dǎo)組的細(xì)胞形態(tài)變化,應(yīng)用Western blot及RT-PCR檢測正常組、Control si RNA 72 h組、ILEI si RNA 72 h組、TGF-β1誘導(dǎo)48h組、Control-si RNA 24h+TGF-β1誘導(dǎo)48 h組、ILEI si RNA 24h+TGF-β1誘導(dǎo)48 h組的E-cadherin,α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA的表達(dá)。同樣,使用Transwell小室法檢測各組HK-2細(xì)胞遷移能力的變化。最后,Western blot檢測以上6組細(xì)胞的ERK、p-ERK、Akt、p-Akt蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果:(1)過表達(dá)ILEI的HK-2細(xì)胞發(fā)生形態(tài)向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。(2)過表達(dá)ILEI 72h后,與正常組和vector組相比,過表達(dá)ILEI的HK-2細(xì)胞E-cadherin的蛋白及m RNA表達(dá)減少,而α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA表達(dá)增加。(3)過表達(dá)ILEI的HK-2細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。(4)給予TGF-β1誘導(dǎo)后過表達(dá)ILEI組較單獨(dú)TGF-β1誘導(dǎo)組形態(tài)變化更加明顯,遷移能力增強(qiáng)更加顯著。(5)給予TGF-β1誘導(dǎo)后過表達(dá)ILEI組E-cadherin蛋白及m RNA表達(dá)較單獨(dú)TGF-β1誘導(dǎo)組進(jìn)一步減少,α-SMA及Vimentin蛋白及m RNA表達(dá)則進(jìn)一步增加。(6)ILEI si RNA能恢復(fù)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。(7)ILEI si RNA作用于HK-2細(xì)胞后抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA及Vimentin的蛋白和m RNA表達(dá),ILEI si RNA能恢復(fù)被TGF-β1抑制的E-cadherin蛋白和m RNA的表達(dá)。(8)ILEI si RNA減弱了TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的遷移能力。(9)ILEI si RNA作用于HK-2細(xì)胞后抑制TGF-β1誘導(dǎo)的p-ERK及p-AKT的蛋白水平的表達(dá)。結(jié)論:(1)過表達(dá)ILEI能夠不依賴于TGF-β1獨(dú)立誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。(2)過表達(dá)ILEI可以促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。(3)沉默ILEI能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。(4)沉默ILEI抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是通過AKT及ERK兩條通路實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

141A，TGF-β1 誘導(dǎo)對 HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響(倒置光學(xué)顯微鏡,x200)圖 1B， TGF-β1 對 E-cadherin、α-SMA 及 Vimentin 蛋白表達(dá)的影響(Western blot)圖 1C，TGF-β1 對 E-cadherin 及 Vimentin 蛋白分布的影響(免疫熒光 x400)注:control 代表對照組; 12h、24h、48h、72h 分別代表 TGF-β1 誘導(dǎo)不同時(shí)間組與對照組比較，**代表 P<0.01DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核為藍(lán)色，CY3 標(biāo)記的 E-cadherin 及 Vimentin 為紅色

16圖 2A，不同 TGF-β1 誘導(dǎo)時(shí)間對 E-cadherin、α-SMA 及 Vimentin mRNA 表達(dá)的影響(RT-PCR)圖 2B，不同 TGF-β1 刺激時(shí)間對腎小管上皮細(xì)胞遷移能力的影響注:control 代表對照組;；12h、24h、48h、72h 分別代表 TGF-β1 刺激不同時(shí)間組；與對照組比較,*代表 P<0.05，**代表 P<0.01

18圖 3，TGF-β1 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中 ILEI 蛋白及 mRNA 表達(dá)A.TGF-β1 作用 HK-2 不同濃度對 ILEI 蛋白表達(dá)的影響(Western blot)B.TGF-β1 作用 HK-2 不同時(shí)間對 ILEI 蛋白表達(dá)的影響(Western blot)C.TGF-β1 對 ILEI 蛋白分布的影響(免疫熒光 x400)D.TGF-β1 作用 HK-2 不同濃度對 ILEI mRNA 表達(dá)的影響(RT-PCR)E.TGF-β1 作用 HK-2 不同時(shí)間對 ILEI mRNA 表達(dá)的影響(RT-PCR)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2835292