本文關(guān)鍵詞：CREB在前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是亮氨酸拉鏈(leucine-zipper)轉(zhuǎn)錄因子家族中成員之一。CREB可通過(guò)其肽鏈中第133位絲氨酸的磷酸化募集共激活因子,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,其靶基因參與多種細(xì)胞活動(dòng),包括腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和代謝等。有文獻(xiàn)報(bào)道,CREB可在多種腫瘤如急性白血病、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)和過(guò)度活化,并參與腫瘤的增殖與惡化過(guò)程。相反,在不同的腫瘤細(xì)胞系中下調(diào)CREB的水平可抑制細(xì)胞增殖和并誘導(dǎo)凋亡,提示CREB在腫瘤的增殖及凋亡抵抗中起重要作用。而CREB在前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡抵抗中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。CREB需經(jīng)第133位絲氨酸磷酸化為磷酸化CREB(p-CREB)才能發(fā)揮促轉(zhuǎn)錄激活的作用,而胞內(nèi)CREB的磷酸化及活化需要胞外信號(hào)的刺激誘導(dǎo),目前已知的可參與CREB磷酸化活化的胞外信號(hào)有激素、突觸興奮性水平改變、生長(zhǎng)因子、應(yīng)激及炎癥因子等。而在腫瘤微環(huán)境中,炎癥反應(yīng)與腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)密切相關(guān),而其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)的作用越來(lái)越被人們重視。TAM可通過(guò)促進(jìn)腫瘤新生血管產(chǎn)生、新生淋巴管生成、免疫抑制、促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲等途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而,其相關(guān)機(jī)制尚不十分清楚,而TAM能否作為前列腺癌細(xì)胞的胞外刺激信號(hào)通過(guò)CREB通路參與腫瘤進(jìn)展過(guò)程也未見(jiàn)報(bào)道。鑒于CREB在其他腫瘤組織中的作用及TAM作為腫瘤微環(huán)境的一部分在腫瘤進(jìn)展中的重要性,本研究旨在觀察creb在不同前列腺癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性分析,并探討靜息條件下creb在前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用,及tam能否通過(guò)上調(diào)creb發(fā)揮其促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展的作用。本研究由以下三部分實(shí)驗(yàn)組成:實(shí)驗(yàn)一:研究creb及p-creb在前列腺癌組織及不同前列腺細(xì)胞系中的表達(dá)及可能的功能本實(shí)驗(yàn)第一小部分采用組織芯片免疫組化染色技術(shù),檢測(cè)正常前列腺組織、前列腺增生組織及不同病理分期分級(jí)的前列腺癌組織中的creb及p-creb的表達(dá),并初步分析creb及p-creb的表達(dá)陽(yáng)性率、表達(dá)強(qiáng)度與前列腺組織惡性程度的相關(guān)性。結(jié)果顯示creb及p-creb蛋白水平在前列腺癌組織中表達(dá)明顯高于正常前列腺、前列腺增生組織,且隨前列腺癌分級(jí)越高,陽(yáng)性率越高。結(jié)果提示,隨前列腺組織增殖能力增強(qiáng),creb及p-creb的表達(dá)也升高,creb及p-creb的陽(yáng)性率及表達(dá)強(qiáng)度與前列腺組織惡性程度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)第二小部分采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色及westernblottingting技術(shù),檢測(cè)體外培養(yǎng)的前列腺基質(zhì)細(xì)胞及癌細(xì)胞中creb及p-creb的表達(dá)。結(jié)果顯示,與人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞系wpmy-1相比,前列腺癌細(xì)胞系pc3及l(fā)ncap中creb及p-creb的表達(dá)水平的明顯升高,結(jié)果提示creb及p-creb表達(dá)水平高低與前列腺細(xì)胞的增殖水平或凋亡抵抗可能存在正相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)二:研究creb在前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到creb基因的mrna序列,利用vectornti11.0軟件設(shè)計(jì)引物。以前列腺癌細(xì)胞系lncap的mrna為模板,采用反轉(zhuǎn)錄pcr技術(shù)生成cdna文庫(kù),并進(jìn)一步克隆creb基因的編碼區(qū),鑒定其序列的正確性,表達(dá)于重組質(zhì)粒pcdna3.1-creb中。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染pcdna3.1-creb于前列腺癌細(xì)胞系pc3及l(fā)ncap中,觀察其對(duì)增殖及凋亡的作用。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcdna3.1-creb后,pc3及l(fā)ncap細(xì)胞中的creb及p-creb含量上升,說(shuō)明重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建與表達(dá);同時(shí)觀察到增殖相關(guān)分子pcna顯示出相似的表達(dá)模式,利用cck-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖水平,也表明creb及p-creb含量水平與前列腺癌細(xì)胞增殖水平正相關(guān)。另外,tunel染色結(jié)果進(jìn)一步顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcdna3.1-creb可抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡,可能與凋亡抑制蛋白survivin的表達(dá)升高有關(guān)。相反,采用sirna技術(shù)沉默creb,可降低前列腺癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)三:研究CREB在TAM相關(guān)的前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外采用佛波酯(PMA)誘導(dǎo)血液?jiǎn)魏思?xì)胞系THP-1成為巨噬細(xì)胞,再通過(guò)LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激使巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞,通過(guò)IL-4刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞,分別收集其條件性培養(yǎng)基(conditioned medium)M1-CM和M2-CM。再用兩者分別刺激LNCap和PC3細(xì)胞,觀察其對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,并探討CREB在其中的作用。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,M2型巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)基可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞LNCap及PC3的生長(zhǎng),同時(shí)有CREB上調(diào),而M1型巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)基刺激時(shí)無(wú)顯著變化。而CREB-siRNA可抑制M2-CM促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,提示CREB參與M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展的作用。而M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌什么胞外因子誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞CREB上調(diào)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：CREB p-CREB 前列腺癌 增殖 凋亡 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-16
• 文獻(xiàn)回顧16-32
• 第一部分 CREB及p-CREB在前列腺癌組織及不同前列腺細(xì)胞系中的表達(dá)及可能的功能32-52
• 1 材料32-36
• 1.1 組織芯片32
• 1.2 細(xì)胞系32
• 1.3 相關(guān)試劑32-33
• 1.4 緩沖液33-35
• 1.5 相關(guān)儀器35-36
• 2 方法36-39
• 2.1 不同前列腺組織芯片免疫組化染色36
• 2.2 人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞WPMY-1、前列腺癌細(xì)胞PC3及LNCap的培養(yǎng)36-37
• 2.3 三種不同細(xì)胞系的免疫細(xì)胞化學(xué)染色37-38
• 2.4 Western blotting檢測(cè)三種不同細(xì)胞系的增殖水平（PCNA表達(dá)水平）38-39
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析39
• 3 結(jié)果39-50
• 3.1 CREB在不同前列腺組織中的表達(dá)情況39-42
• 3.2 p-CREB在不同前列腺組織中的表達(dá)情況42-48
• 3.3 CREB在不同前列腺細(xì)胞中的表達(dá)情況48-49
• 3.4 p-CREB在不同前列腺細(xì)胞中的表達(dá)情況49
• 3.5 Western blotting檢測(cè)CREB及p-CREB在WPMY-1、PC3及LNCap細(xì)胞中的表達(dá)49-50
• 4 討論50-52
• 第二部分 CREB在前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用52-71
• 1 材料52-54
• 1.1 感受態(tài)菌株52
• 1.2 細(xì)胞系52
• 1.3 相關(guān)試劑52-53
• 1.4 培養(yǎng)基（液）及緩沖液53
• 1.5 相關(guān)儀器53-54
• 2 方法54-61
• 2.1 E.coli JM109感受態(tài)的制備54
• 2.2 LNCap細(xì)胞的總RNA提取54
• 2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA54-55
• 2.4 PCR擴(kuò)增CREB基因編碼區(qū)55
• 2.5 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離及膠回收55-56
• 2.6 將DNA回收產(chǎn)物和pcDNA3.1 質(zhì)粒連接重組56-57
• 2.7 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CREB的擴(kuò)增和鑒定57
• 2.8 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CREB的轉(zhuǎn)染57-58
• 2.9 轉(zhuǎn)染CREB-siRNA58
• 2.10 檢測(cè)CREB轉(zhuǎn)染效率58-59
• 2.11 CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖水平59
• 2.12 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡59-60
• 2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析60-61
• 3 結(jié)果61-69
• 3.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CREB的鑒定結(jié)果61-63
• 3.2 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CREB對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖水平的影響63-66
• 3.3 轉(zhuǎn)染CREB-siRNA對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖水平的影響66-67
• 3.4 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CREB及CREB-siRNA對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響67-68
• 3.5 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CREB及CREB-siRNA影響前列腺癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制68-69
• 4 討論69-71
• 第三部分 CREB在TAM相關(guān)的前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用71-80
• 1 材料71-72
• 1.1 細(xì)胞系71
• 1.2 相關(guān)試劑71-72
• 1.3 相關(guān)儀器72
• 2 方法72-74
• 2.1 血液?jiǎn)魏思?xì)胞系THP-1 的培養(yǎng)及其巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)72
• 2.2 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1及M2型分化72-73
• 2.3 收集M1及M2型巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)基73
• 2.4 M1及M2型巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)基刺激前列腺癌細(xì)胞73
• 2.5 Western blotting73
• 2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)染色73-74
• 2.7 CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖水平74
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析74
• 3 結(jié)果74-79
• 3.1 鑒定血液?jiǎn)魏思?xì)胞系THP-1 向巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)74-75
• 3.2 鑒定巨噬細(xì)胞向M1及M2表型誘導(dǎo)75-76
• 3.3 M2型巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)基對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響76-77
• 3.4 CREB在M2型巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)基促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用77-79
• 4 討論79-80
• 小結(jié)80-81
• 參考文獻(xiàn)81-93
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果93-94
• 致謝94

  本文關(guān)鍵詞：CREB在前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：283150