本文關鍵詞：CREB在前列腺癌細胞增殖與凋亡中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是亮氨酸拉鏈(leucine-zipper)轉錄因子家族中成員之一。CREB可通過其肽鏈中第133位絲氨酸的磷酸化募集共激活因子,調控基因轉錄,其靶基因參與多種細胞活動,包括腫瘤的發(fā)生、進展和代謝等。有文獻報道,CREB可在多種腫瘤如急性白血病、乳腺癌、非小細胞肺癌中過表達和過度活化,并參與腫瘤的增殖與惡化過程。相反,在不同的腫瘤細胞系中下調CREB的水平可抑制細胞增殖和并誘導凋亡,提示CREB在腫瘤的增殖及凋亡抵抗中起重要作用。而CREB在前列腺癌細胞增殖與凋亡抵抗中的作用尚未見報道。CREB需經第133位絲氨酸磷酸化為磷酸化CREB(p-CREB)才能發(fā)揮促轉錄激活的作用,而胞內CREB的磷酸化及活化需要胞外信號的刺激誘導,目前已知的可參與CREB磷酸化活化的胞外信號有激素、突觸興奮性水平改變、生長因子、應激及炎癥因子等。而在腫瘤微環(huán)境中,炎癥反應與腫瘤的持續(xù)生長密切相關,而其中腫瘤相關巨噬細胞(TAM)的作用越來越被人們重視。TAM可通過促進腫瘤新生血管產生、新生淋巴管生成、免疫抑制、促進腫瘤遷移和侵襲等途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而,其相關機制尚不十分清楚,而TAM能否作為前列腺癌細胞的胞外刺激信號通過CREB通路參與腫瘤進展過程也未見報道。鑒于CREB在其他腫瘤組織中的作用及TAM作為腫瘤微環(huán)境的一部分在腫瘤進展中的重要性,本研究旨在觀察creb在不同前列腺癌組織中的表達及其相關性分析,并探討靜息條件下creb在前列腺癌細胞增殖與凋亡中的作用,及tam能否通過上調creb發(fā)揮其促進前列腺癌進展的作用。本研究由以下三部分實驗組成:實驗一:研究creb及p-creb在前列腺癌組織及不同前列腺細胞系中的表達及可能的功能本實驗第一小部分采用組織芯片免疫組化染色技術,檢測正常前列腺組織、前列腺增生組織及不同病理分期分級的前列腺癌組織中的creb及p-creb的表達,并初步分析creb及p-creb的表達陽性率、表達強度與前列腺組織惡性程度的相關性。結果顯示creb及p-creb蛋白水平在前列腺癌組織中表達明顯高于正常前列腺、前列腺增生組織,且隨前列腺癌分級越高,陽性率越高。結果提示,隨前列腺組織增殖能力增強,creb及p-creb的表達也升高,creb及p-creb的陽性率及表達強度與前列腺組織惡性程度呈現(xiàn)正相關關系。本實驗第二小部分采用免疫細胞化學染色及westernblottingting技術,檢測體外培養(yǎng)的前列腺基質細胞及癌細胞中creb及p-creb的表達。結果顯示,與人正常前列腺基質永生化細胞系wpmy-1相比,前列腺癌細胞系pc3及l(fā)ncap中creb及p-creb的表達水平的明顯升高,結果提示creb及p-creb表達水平高低與前列腺細胞的增殖水平或凋亡抵抗可能存在正相關關系。實驗二:研究creb在前列腺癌細胞增殖與凋亡中的作用本實驗通過ncbi數(shù)據(jù)庫檢索到creb基因的mrna序列,利用vectornti11.0軟件設計引物。以前列腺癌細胞系lncap的mrna為模板,采用反轉錄pcr技術生成cdna文庫,并進一步克隆creb基因的編碼區(qū),鑒定其序列的正確性,表達于重組質粒pcdna3.1-creb中。進一步轉染pcdna3.1-creb于前列腺癌細胞系pc3及l(fā)ncap中,觀察其對增殖及凋亡的作用。結果顯示,轉染重組質粒pcdna3.1-creb后,pc3及l(fā)ncap細胞中的creb及p-creb含量上升,說明重組質粒的成功構建與表達;同時觀察到增殖相關分子pcna顯示出相似的表達模式,利用cck-8試劑盒檢測細胞增殖水平,也表明creb及p-creb含量水平與前列腺癌細胞增殖水平正相關。另外,tunel染色結果進一步顯示轉染重組質粒pcdna3.1-creb可抑制前列腺癌細胞凋亡,可能與凋亡抑制蛋白survivin的表達升高有關。相反,采用sirna技術沉默creb,可降低前列腺癌細胞增殖,并促進其細胞凋亡。實驗三:研究CREB在TAM相關的前列腺癌細胞生長中的作用本實驗通過體外采用佛波酯(PMA)誘導血液單核細胞系THP-1成為巨噬細胞,再通過LPS+IFN-γ聯(lián)合刺激使巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞,通過IL-4刺激誘導巨噬細胞極化為M2型巨噬細胞,分別收集其條件性培養(yǎng)基(conditioned medium)M1-CM和M2-CM。再用兩者分別刺激LNCap和PC3細胞,觀察其對前列腺癌細胞生長的影響,并探討CREB在其中的作用。CCK-8檢測結果顯示,M2型巨噬細胞條件性培養(yǎng)基可促進前列腺癌細胞LNCap及PC3的生長,同時有CREB上調,而M1型巨噬細胞條件性培養(yǎng)基刺激時無顯著變化。而CREB-siRNA可抑制M2-CM促進前列腺癌細胞生長的作用,提示CREB參與M2型巨噬細胞促進前列腺癌進展的作用。而M2型巨噬細胞通過分泌什么胞外因子誘導前列腺癌細胞CREB上調的機制有待進一步研究。
【關鍵詞】：CREB p-CREB 前列腺癌 增殖 凋亡 腫瘤相關巨噬細胞(TAM)
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-16
• 文獻回顧16-32
• 第一部分 CREB及p-CREB在前列腺癌組織及不同前列腺細胞系中的表達及可能的功能32-52
• 1 材料32-36
• 1.1 組織芯片32
• 1.2 細胞系32
• 1.3 相關試劑32-33
• 1.4 緩沖液33-35
• 1.5 相關儀器35-36
• 2 方法36-39
• 2.1 不同前列腺組織芯片免疫組化染色36
• 2.2 人正常前列腺基質永生化細胞WPMY-1、前列腺癌細胞PC3及LNCap的培養(yǎng)36-37
• 2.3 三種不同細胞系的免疫細胞化學染色37-38
• 2.4 Western blotting檢測三種不同細胞系的增殖水平（PCNA表達水平）38-39
• 2.5 統(tǒng)計學分析39
• 3 結果39-50
• 3.1 CREB在不同前列腺組織中的表達情況39-42
• 3.2 p-CREB在不同前列腺組織中的表達情況42-48
• 3.3 CREB在不同前列腺細胞中的表達情況48-49
• 3.4 p-CREB在不同前列腺細胞中的表達情況49
• 3.5 Western blotting檢測CREB及p-CREB在WPMY-1、PC3及LNCap細胞中的表達49-50
• 4 討論50-52
• 第二部分 CREB在前列腺癌細胞增殖與凋亡中的作用52-71
• 1 材料52-54
• 1.1 感受態(tài)菌株52
• 1.2 細胞系52
• 1.3 相關試劑52-53
• 1.4 培養(yǎng)基（液）及緩沖液53
• 1.5 相關儀器53-54
• 2 方法54-61
• 2.1 E.coli JM109感受態(tài)的制備54
• 2.2 LNCap細胞的總RNA提取54
• 2.3 反轉錄合成cDNA54-55
• 2.4 PCR擴增CREB基因編碼區(qū)55
• 2.5 產物瓊脂糖凝膠電泳分離及膠回收55-56
• 2.6 將DNA回收產物和pcDNA3.1 質粒連接重組56-57
• 2.7 重組質粒pcDNA3.1-CREB的擴增和鑒定57
• 2.8 重組質粒pcDNA3.1-CREB的轉染57-58
• 2.9 轉染CREB-siRNA58
• 2.10 檢測CREB轉染效率58-59
• 2.11 CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖水平59
• 2.12 TUNEL染色檢測細胞凋亡59-60
• 2.13 統(tǒng)計學分析60-61
• 3 結果61-69
• 3.1 重組質粒pcDNA3.1-CREB的鑒定結果61-63
• 3.2 轉染重組質粒pcDNA3.1-CREB對前列腺癌細胞增殖水平的影響63-66
• 3.3 轉染CREB-siRNA對前列腺癌細胞增殖水平的影響66-67
• 3.4 轉染pcDNA3.1-CREB及CREB-siRNA對前列腺癌細胞凋亡的影響67-68
• 3.5 轉染pcDNA3.1-CREB及CREB-siRNA影響前列腺癌細胞凋亡的可能機制68-69
• 4 討論69-71
• 第三部分 CREB在TAM相關的前列腺癌細胞生長中的作用71-80
• 1 材料71-72
• 1.1 細胞系71
• 1.2 相關試劑71-72
• 1.3 相關儀器72
• 2 方法72-74
• 2.1 血液單核細胞系THP-1 的培養(yǎng)及其巨噬細胞誘導72
• 2.2 誘導巨噬細胞向M1及M2型分化72-73
• 2.3 收集M1及M2型巨噬細胞條件性培養(yǎng)基73
• 2.4 M1及M2型巨噬細胞條件性培養(yǎng)基刺激前列腺癌細胞73
• 2.5 Western blotting73
• 2.6 免疫細胞化學染色73-74
• 2.7 CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖水平74
• 2.8 統(tǒng)計學分析74
• 3 結果74-79
• 3.1 鑒定血液單核細胞系THP-1 向巨噬細胞的誘導74-75
• 3.2 鑒定巨噬細胞向M1及M2表型誘導75-76
• 3.3 M2型巨噬細胞條件性培養(yǎng)基對前列腺癌細胞生長的影響76-77
• 3.4 CREB在M2型巨噬細胞條件性培養(yǎng)基促進前列腺癌細胞生長中的作用77-79
• 4 討論79-80
• 小結80-81
• 參考文獻81-93
• 個人簡歷和研究成果93-94
• 致謝94

  本文關鍵詞：CREB在前列腺癌細胞增殖與凋亡中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：283150