目的目前,不孕不育癥是影響人類健康的一種常見的疾病,約15%的育齡人員有不孕不育疾病的問題,在這里約百分之五十是因為男性原因,在醫(yī)學中被稱之為男性不育。然而,在臨床就診的男性不育癥患者中,無精子癥患者的治療最為棘手。根據(jù)患者有無輸精管梗阻的表現(xiàn),臨床上將無精癥分為梗阻性無精癥(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性無精癥(non-obstructive azoospermia,NOA)兩種,其中NOA患者睪丸生精功能嚴重障礙,多次精液常規(guī)檢查報告提示鏡下見極少量精子或沒有精子。NOA患者的睪丸組織病理表型有睪丸生精小管結構紊亂、生精細胞成熟阻滯、生精細胞減數(shù)分裂停滯、睪丸生精功能低下等。盡管輔助生殖技術已經(jīng)幫助很多不育夫婦成功受孕,然而很多NOA患者仍然無法生育自己遺傳學上的后代。近年來,關于引起NOA相關的基因突變或多態(tài)性現(xiàn)象逐漸成為男性不育癥研究的的熱點。因此,針對NOA患者精子發(fā)生過程中的相關分子生物學機制的深入研究,不僅有助于逐步了解NOA的發(fā)病原因,對于男性不育癥靶控治療的發(fā)展和輔助生殖技術均有著非常重要的理論指導及應用價值。CD82是近些年在腫瘤領域研究較多的轉移抑制基因之一,它屬于四穿膜超家族(Transmernbrance 4 superfamily,TM4SF)的成員,其結構為細胞膜糖蛋白,主要生物學功能是對細胞間及細胞與細胞外基質的信號傳導產(chǎn)生影響,同時參與調節(jié)細胞的增殖與分化。其參與的生物學途徑有細胞周期調控、細胞骨架結構改變、蛋白激酶磷酸化調節(jié)、細胞凋亡調控、細胞粘附/遷移等。研究發(fā)現(xiàn),在NOA患者睪丸的組織中CD82呈高表達。目前,關于CD82的過表達是否會引起精原細胞分化、增殖過程發(fā)生異常進而引起精子生成障礙,國內外前尚無相關的研究及文章報道。本實驗首先檢測部分梗阻性以及非梗阻性無精子癥患者睪丸組織中CD82蛋白的表達情況,比較分析了二組標本之間存在的差異表達,通過向小鼠睪丸組織顯微注射CD82轉染的腺相關病毒,構建CD82高表達小鼠睪丸組織模型,分析驗證了CD82高表達對小鼠生精細胞分化增殖產(chǎn)生的影響,并采用高通量轉錄組測序的方法對CD82可能引起生精障礙的分子生物學途徑進行探討,為進一步尋找CD82在生精細胞分化過程中相關的分子機制提供理論基礎。方法1.HE染色觀察無精子癥患者睪丸組織中生精細胞不同的形態(tài)學表現(xiàn),免疫組化觀察CD82在梗阻性和非梗阻性無精子癥患者睪丸組織中的表達情況。2.采用Western blot進行定量檢測CD82在梗阻性和非梗阻性無精子癥患者睪丸組織中差異表達。3.包裝表達CD82的腺相關病毒(AVV),顯微注射法感染小鼠睪丸組織,構建CD82高表達小鼠睪丸組織模型,免疫熒光觀察AVV感染效率。4.HE染色觀察CD82高表達對小鼠睪丸組織精子發(fā)生的影響。5.轉錄組測序檢測CD82高表達小鼠睪丸實驗組和對照組之間的差異表達基因。6.隨機挑選6個差異表達基因,Q-RTPCR驗證高通量轉錄組測序結果的可靠性。結果1.HE染色觀察無精子癥患者睪丸組織存在不同形態(tài)學改變,其中5例患者生精功能正常,表現(xiàn)為曲細精管密度正常,管腔基底部各級生精細胞存在,管腔內可見成熟精子形成,符合梗阻性無精子癥患者病理改變;8例患者生精功能障礙,表現(xiàn)為曲細精管稀疏,管腔基地部各級生精細胞數(shù)量減少,厚度變薄,管腔內極少有成熟精子形成,符合非梗阻性無精子癥睪丸病理改變。2.免疫組化結果顯示,梗阻性和非梗阻性無精子癥患者睪丸組織內間質細胞和支持細胞均可見CD82陽性表達,非梗阻性無精子癥患CD82表達更為顯著,采用Western blot法進行定量檢測,結果顯示在二組睪丸標本中CD82蛋白的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P值0.05)。3.CD82成功插入腺相關病毒AVV載體,顯微注射法成功感染小鼠睪丸組織,1周后免疫熒光顯示小鼠睪丸組織外源性CD82表達明顯,CD82高表達小鼠睪丸組織模型構建滿意。4.C57小鼠(8周齡)睪丸組織的HE染色結果顯示,對照組小鼠睪丸組織的生精功能正常,各級生精細胞生長活躍,曲細精管內可見到部分成熟精子,實驗組小鼠睪丸組織呈現(xiàn)生精功能異常,各級生精細胞數(shù)量減少,管壁變薄,無成熟精子或僅極少量長形精子形成。5.轉錄組測序結果顯示,與對照組相比,CD82高表達組差異表達基因數(shù)590個,其中上調基因289個,下調基因301個,主要參與的生物過程包括有細胞周期調控、轉錄因子調節(jié)、細胞凋亡調節(jié)、信號傳導通路、免疫應答反應、細胞粘附轉運、蛋白磷酸化等方面,其中細胞周期調控、轉錄調節(jié)相關基因所占比例較大。6.隨機挑選的6個差異基因,各選三份組織樣本進行Q-RTPCR驗證,分析結果提示基因表達變化水平與高通量轉錄組測序結果趨勢一致,轉錄組測序結果可靠。結論:1.在OA和NOA患者睪丸組織中,CD82檢測結果均呈陽性表達,NOA患者睪丸組中CD82表達更為顯著,定量檢測法(Western blot)檢測兩組標本組織的CD82蛋白差異表達有統(tǒng)計學意義2.在高表達CD82小鼠睪丸組織中,曲細精管基底室生殖細胞結構尚清晰,近腔室內生殖細胞減少,極少量精子形成,生殖細胞分化停滯在精原細胞及初級精母細胞早期,預示CD82過表達可能會引起精原細胞分化、有絲分裂-增殖過程發(fā)生異常。3.高通量轉錄組測序顯示高表達CD82時差異基因所參與的生物學過程和信號通路涉及細胞周期調控、轉錄因子調節(jié)、細胞凋亡調節(jié)、信號傳導通路、免疫應答反應、細胞粘附轉運、蛋白磷酸化等方面,細胞周期調控和轉錄調節(jié)可能是CD82在精子發(fā)生障礙過程中的重要調控環(huán)節(jié)。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R698.2
【部分圖文】：

圖 1 NOA 病理類型（Stukenborg JB and Kjartansdóttir KR，2014）a)正常的精子出現(xiàn)；(b)生殖細胞減數(shù)分裂暫停，不能完整進行；(c)生殖細胞減數(shù)分不能完成；(d)唯支持細胞綜合癥。左圖表現(xiàn)的是: 無疾病的成年睪丸生精小管表細胞種類(不一樣顏色代碼進行區(qū)分)，包含在生殖細胞以及體細胞間的細胞。右精子生成過程中出現(xiàn)障礙的曲細精管表現(xiàn)圖及對應的組織樣本的免疫學染色圖片。Fig.1 NOA is divided into the following types：(a) the appearance of normal sperm; (b) the meiosis of germ cells is suspended and canleted; (c) suspension before meiosis of germ cells， which cannot be completed; (d

圖 2 睪丸-附睪解剖模式圖(Cooke HJ and Saunders PT，2002)(a)睪丸白膜為一層堅厚的纖維膜，沿睪丸后緣白膜逐漸增厚，凸入睪丸內形成睪丸縱隔由發(fā)出許多結締組織小隔，將睪丸實質分隔成諸多睪丸小葉。睪丸小葉內含有迂曲細精管。(b)睪丸橫切圖展示了不同分化階段的生精細胞(綠色)嵌在支持細胞(Sertoli分化發(fā)育，間質細胞(Leydig cell，LC) 具有睪酮分泌功能，分布在管外，而逐級成熟管腔中央部分。管周肌樣細胞（Peritubularmyoidcell，PTM）。Fig.2 Anatomy model of testicular - epididymiste :(a) the tunica albuginea of the testis is a thick fibrous membrane， which gradually thicng the posterior margin of the testis and protrudes into the testis to form the mediastinum otis. Many connective tissue septum from the mediastinum， dividing the parenchyma of the o numerous lobules. Testicular lobule contains a tortuous circumflex spines. (b) testinsection showed the differentiation and development of spermatogenic cells (green) at diffferentiation stages embedded in Sertoli cell， and Leydig cell had the function of testosteretion， distributed outside the tube，while the progressively mature sperm was in the centrathe tube cavity. PTM，perituzummyoid cell .

期循環(huán)方式進行的。整個精子發(fā)生(spermatogenesis)是在睪丸組織的miniferoustubule，又稱生精小管)中完成。曲細精管主要由三類細胞組胞( peritubularmyoid cell，PTM)、支持細胞(sertoli cell)和生殖細胞(ger樣細胞位于生精小管的上皮外基膜，能協(xié)助管內精子及液體的排出胞與支持細胞共同構成成曲細精管的基底膜部分[26,27]。支持細胞能細胞提供營養(yǎng)支持，傳遞外部信號，同時分泌生精細胞增殖-分化不的諸多細胞因子。支持細胞在曲細精管的最低端延伸到上皮的全層發(fā)育一直到變成成熟精子的全部生理、形態(tài)改變過程也都沿著支持行。它的排列順序為：緊貼曲細精管的基底膜的單倍體精原細胞位次分別為精原、初級精母、次級精母、精子、分化的精子，成熟的細精管的管腔內[22]。(圖 3 )。

【參考文獻】

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1 劉興章;唐運革;鄭立新;周冰q

本文編號：2830457