目的目前,不孕不育癥是影響人類健康的一種常見的疾病,約15%的育齡人員有不孕不育疾病的問題,在這里約百分之五十是因?yàn)槟行栽?在醫(yī)學(xué)中被稱之為男性不育。然而,在臨床就診的男性不育癥患者中,無精子癥患者的治療最為棘手。根據(jù)患者有無輸精管梗阻的表現(xiàn),臨床上將無精癥分為梗阻性無精癥(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性無精癥(non-obstructive azoospermia,NOA)兩種,其中NOA患者睪丸生精功能嚴(yán)重障礙,多次精液常規(guī)檢查報告提示鏡下見極少量精子或沒有精子。NOA患者的睪丸組織病理表型有睪丸生精小管結(jié)構(gòu)紊亂、生精細(xì)胞成熟阻滯、生精細(xì)胞減數(shù)分裂停滯、睪丸生精功能低下等。盡管輔助生殖技術(shù)已經(jīng)幫助很多不育夫婦成功受孕,然而很多NOA患者仍然無法生育自己遺傳學(xué)上的后代。近年來,關(guān)于引起NOA相關(guān)的基因突變或多態(tài)性現(xiàn)象逐漸成為男性不育癥研究的的熱點(diǎn)。因此,針對NOA患者精子發(fā)生過程中的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制的深入研究,不僅有助于逐步了解NOA的發(fā)病原因,對于男性不育癥靶控治療的發(fā)展和輔助生殖技術(shù)均有著非常重要的理論指導(dǎo)及應(yīng)用價值。CD82是近些年在腫瘤領(lǐng)域研究較多的轉(zhuǎn)移抑制基因之一,它屬于四穿膜超家族(Transmernbrance 4 superfamily,TM4SF)的成員,其結(jié)構(gòu)為細(xì)胞膜糖蛋白,主要生物學(xué)功能是對細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生影響,同時參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化。其參與的生物學(xué)途徑有細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變、蛋白激酶磷酸化調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞粘附/遷移等。研究發(fā)現(xiàn),在NOA患者睪丸的組織中CD82呈高表達(dá)。目前,關(guān)于CD82的過表達(dá)是否會引起精原細(xì)胞分化、增殖過程發(fā)生異常進(jìn)而引起精子生成障礙,國內(nèi)外前尚無相關(guān)的研究及文章報道。本實(shí)驗(yàn)首先檢測部分梗阻性以及非梗阻性無精子癥患者睪丸組織中CD82蛋白的表達(dá)情況,比較分析了二組標(biāo)本之間存在的差異表達(dá),通過向小鼠睪丸組織顯微注射CD82轉(zhuǎn)染的腺相關(guān)病毒,構(gòu)建CD82高表達(dá)小鼠睪丸組織模型,分析驗(yàn)證了CD82高表達(dá)對小鼠生精細(xì)胞分化增殖產(chǎn)生的影響,并采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序的方法對CD82可能引起生精障礙的分子生物學(xué)途徑進(jìn)行探討,為進(jìn)一步尋找CD82在生精細(xì)胞分化過程中相關(guān)的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法1.HE染色觀察無精子癥患者睪丸組織中生精細(xì)胞不同的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),免疫組化觀察CD82在梗阻性和非梗阻性無精子癥患者睪丸組織中的表達(dá)情況。2.采用Western blot進(jìn)行定量檢測CD82在梗阻性和非梗阻性無精子癥患者睪丸組織中差異表達(dá)。3.包裝表達(dá)CD82的腺相關(guān)病毒(AVV),顯微注射法感染小鼠睪丸組織,構(gòu)建CD82高表達(dá)小鼠睪丸組織模型,免疫熒光觀察AVV感染效率。4.HE染色觀察CD82高表達(dá)對小鼠睪丸組織精子發(fā)生的影響。5.轉(zhuǎn)錄組測序檢測CD82高表達(dá)小鼠睪丸實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的差異表達(dá)基因。6.隨機(jī)挑選6個差異表達(dá)基因,Q-RTPCR驗(yàn)證高通量轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。結(jié)果1.HE染色觀察無精子癥患者睪丸組織存在不同形態(tài)學(xué)改變,其中5例患者生精功能正常,表現(xiàn)為曲細(xì)精管密度正常,管腔基底部各級生精細(xì)胞存在,管腔內(nèi)可見成熟精子形成,符合梗阻性無精子癥患者病理改變;8例患者生精功能障礙,表現(xiàn)為曲細(xì)精管稀疏,管腔基地部各級生精細(xì)胞數(shù)量減少,厚度變薄,管腔內(nèi)極少有成熟精子形成,符合非梗阻性無精子癥睪丸病理改變。2.免疫組化結(jié)果顯示,梗阻性和非梗阻性無精子癥患者睪丸組織內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞均可見CD82陽性表達(dá),非梗阻性無精子癥患CD82表達(dá)更為顯著,采用Western blot法進(jìn)行定量檢測,結(jié)果顯示在二組睪丸標(biāo)本中CD82蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值0.05)。3.CD82成功插入腺相關(guān)病毒AVV載體,顯微注射法成功感染小鼠睪丸組織,1周后免疫熒光顯示小鼠睪丸組織外源性CD82表達(dá)明顯,CD82高表達(dá)小鼠睪丸組織模型構(gòu)建滿意。4.C57小鼠(8周齡)睪丸組織的HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠睪丸組織的生精功能正常,各級生精細(xì)胞生長活躍,曲細(xì)精管內(nèi)可見到部分成熟精子,實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸組織呈現(xiàn)生精功能異常,各級生精細(xì)胞數(shù)量減少,管壁變薄,無成熟精子或僅極少量長形精子形成。5.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,與對照組相比,CD82高表達(dá)組差異表達(dá)基因數(shù)590個,其中上調(diào)基因289個,下調(diào)基因301個,主要參與的生物過程包括有細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)通路、免疫應(yīng)答反應(yīng)、細(xì)胞粘附轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白磷酸化等方面,其中細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因所占比例較大。6.隨機(jī)挑選的6個差異基因,各選三份組織樣本進(jìn)行Q-RTPCR驗(yàn)證,分析結(jié)果提示基因表達(dá)變化水平與高通量轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢一致,轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。結(jié)論:1.在OA和NOA患者睪丸組織中,CD82檢測結(jié)果均呈陽性表達(dá),NOA患者睪丸組中CD82表達(dá)更為顯著,定量檢測法(Western blot)檢測兩組標(biāo)本組織的CD82蛋白差異表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義2.在高表達(dá)CD82小鼠睪丸組織中,曲細(xì)精管基底室生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚清晰,近腔室內(nèi)生殖細(xì)胞減少,極少量精子形成,生殖細(xì)胞分化停滯在精原細(xì)胞及初級精母細(xì)胞早期,預(yù)示CD82過表達(dá)可能會引起精原細(xì)胞分化、有絲分裂-增殖過程發(fā)生異常。3.高通量轉(zhuǎn)錄組測序顯示高表達(dá)CD82時差異基因所參與的生物學(xué)過程和信號通路涉及細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)通路、免疫應(yīng)答反應(yīng)、細(xì)胞粘附轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白磷酸化等方面,細(xì)胞周期調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可能是CD82在精子發(fā)生障礙過程中的重要調(diào)控環(huán)節(jié)。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R698.2
【部分圖文】：

圖 1 NOA 病理類型（Stukenborg JB and Kjartansdóttir KR，2014）a)正常的精子出現(xiàn)；(b)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂暫停，不能完整進(jìn)行；(c)生殖細(xì)胞減數(shù)分不能完成；(d)唯支持細(xì)胞綜合癥。左圖表現(xiàn)的是: 無疾病的成年睪丸生精小管表細(xì)胞種類(不一樣顏色代碼進(jìn)行區(qū)分)，包含在生殖細(xì)胞以及體細(xì)胞間的細(xì)胞。右精子生成過程中出現(xiàn)障礙的曲細(xì)精管表現(xiàn)圖及對應(yīng)的組織樣本的免疫學(xué)染色圖片。Fig.1 NOA is divided into the following types：(a) the appearance of normal sperm; (b) the meiosis of germ cells is suspended and canleted; (c) suspension before meiosis of germ cells， which cannot be completed; (d

圖 2 睪丸-附睪解剖模式圖(Cooke HJ and Saunders PT，2002)(a)睪丸白膜為一層堅(jiān)厚的纖維膜，沿睪丸后緣白膜逐漸增厚，凸入睪丸內(nèi)形成睪丸縱隔由發(fā)出許多結(jié)締組織小隔，將睪丸實(shí)質(zhì)分隔成諸多睪丸小葉。睪丸小葉內(nèi)含有迂曲細(xì)精管。(b)睪丸橫切圖展示了不同分化階段的生精細(xì)胞(綠色)嵌在支持細(xì)胞(Sertoli分化發(fā)育，間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell，LC) 具有睪酮分泌功能，分布在管外，而逐級成熟管腔中央部分。管周肌樣細(xì)胞（Peritubularmyoidcell，PTM）。Fig.2 Anatomy model of testicular - epididymiste :(a) the tunica albuginea of the testis is a thick fibrous membrane， which gradually thicng the posterior margin of the testis and protrudes into the testis to form the mediastinum otis. Many connective tissue septum from the mediastinum， dividing the parenchyma of the o numerous lobules. Testicular lobule contains a tortuous circumflex spines. (b) testinsection showed the differentiation and development of spermatogenic cells (green) at diffferentiation stages embedded in Sertoli cell， and Leydig cell had the function of testosteretion， distributed outside the tube，while the progressively mature sperm was in the centrathe tube cavity. PTM，perituzummyoid cell .

期循環(huán)方式進(jìn)行的。整個精子發(fā)生(spermatogenesis)是在睪丸組織的miniferoustubule，又稱生精小管)中完成。曲細(xì)精管主要由三類細(xì)胞組胞( peritubularmyoid cell，PTM)、支持細(xì)胞(sertoli cell)和生殖細(xì)胞(ger樣細(xì)胞位于生精小管的上皮外基膜，能協(xié)助管內(nèi)精子及液體的排出胞與支持細(xì)胞共同構(gòu)成成曲細(xì)精管的基底膜部分[26,27]。支持細(xì)胞能細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，傳遞外部信號，同時分泌生精細(xì)胞增殖-分化不的諸多細(xì)胞因子。支持細(xì)胞在曲細(xì)精管的最低端延伸到上皮的全層發(fā)育一直到變成成熟精子的全部生理、形態(tài)改變過程也都沿著支持行。它的排列順序?yàn)椋壕o貼曲細(xì)精管的基底膜的單倍體精原細(xì)胞位次分別為精原、初級精母、次級精母、精子、分化的精子，成熟的細(xì)精管的管腔內(nèi)[22]。(圖 3 )。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉興章;唐運(yùn)革;鄭立新;周冰q

本文編號：2830457