前列腺癌的發(fā)病率在全球居于第四位,在男性中居于第二位,是男性當(dāng)中最為常見的惡性腫瘤。2018年,前列腺癌在全球和中國的死亡例數(shù)分別為35.9萬和2.3萬,轉(zhuǎn)移是造成前列腺癌患者死亡的主要原因。目前,前列腺癌的治療手段十分有限,且副作用大,病人會(huì)對(duì)有些治療方式產(chǎn)生抗性,因此,深入研究前列腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為其臨床治療提供新的藥物靶點(diǎn),在理論和臨床上具有重要意義。酪氨酸激酶分為受體酪氨酸激酶和非受體酪氨酸激酶兩大類,在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長、增殖、分化和存活等過程中具重要作用。酪氨酸激酶及其下游信號(hào)通路PI3K/Akt、MAPK、JAK/STAT的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),是腫瘤靶向治療的研發(fā)熱點(diǎn)領(lǐng)域。TNK1是近年發(fā)現(xiàn)的具有促癌活性的非受體酪氨酸激酶之一。研究表明,TNK1與腫瘤的發(fā)生相關(guān),其在人源腫瘤樣本中的表達(dá)水平升高,對(duì)腫瘤細(xì)胞中的PI3K/Akt和JAK/STAT通路具有調(diào)節(jié)作用,可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活,并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。但這些研究?jī)H限于對(duì)現(xiàn)象的觀察,并未對(duì)TNK1的激活機(jī)制及其下游靶分子進(jìn)行具體的分析,本論文對(duì)此進(jìn)行了初步的探討。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明,TNK1表達(dá)于人前列腺癌細(xì)胞系PC-3、DU145、LNCaP中,在人前列腺癌組織中,TNK1的表達(dá)明顯高于癌旁組織,提示TNK1在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中可能具有重要的作用。為進(jìn)一步研究TNK1在前列腺癌細(xì)胞中的功能,本論文利用CRISPR/Cas技術(shù)構(gòu)建了TNK1表達(dá)缺失的人前列腺癌細(xì)胞系。對(duì)三段sgRNA序列的初步篩選結(jié)果顯示,靶向TNK1激酶編碼區(qū)的sgRNA2和sgRNA3的基因編輯效率優(yōu)于靶向N-端外顯子的sgRNA1,表現(xiàn)為前二者能夠更有效地下調(diào)TNK1的表達(dá)。基于此,本文將含sgRNA2或sgRNA3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PC-3細(xì)胞,篩選G418抗性細(xì)胞克隆,每段序列篩選48個(gè)克隆,分別編號(hào)為2CX和3CX(X=1-48)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,sgRNA2或sgRNA3的基因編輯效率相同,均可使25%的細(xì)胞克隆不表達(dá)TNK1。從部分TNK1表達(dá)缺失的細(xì)胞克隆中提取基因組DNA,進(jìn)行PCR,并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)TNK1表達(dá)缺失是由于非同框移碼突變?cè)斐�。本文從中選取具有不同移碼突變的細(xì)胞克隆2C29和2C40進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)表明,TNK1缺失對(duì)PC-3細(xì)胞克隆形成的數(shù)目無明顯影響,但顯著減少了克隆的平均面積,提示TNK1缺失抑制細(xì)胞增殖,但不影響細(xì)胞的密度依賴性生長。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示,TNK1缺失顯著抑制細(xì)胞遷移,且明顯改變遷移細(xì)胞的形態(tài),抑制遷移細(xì)胞在膜上的鋪展。此外,TNK1缺失下調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子vimentin和N-cadherin的表達(dá),說明TNK1缺失抑制腫瘤細(xì)胞的EMT過程。對(duì)PC-3細(xì)胞中信號(hào)通路的分析表明,TNK1缺失顯著抑制STAT3活性位點(diǎn)Y705的磷酸化,但對(duì)Akt和ERK1/2的磷酸化無明顯影響,提示TNK1通過JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)PC-3的細(xì)胞應(yīng)答。綜上,本論文首次發(fā)現(xiàn)非受體酪氨酸激酶TNK1可通過磷酸化STAT3的活性位點(diǎn)Y705而促進(jìn)PC-3細(xì)胞的增殖、遷移和EMT,揭示了TNK1調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞應(yīng)答的新機(jī)制,為前列腺癌的臨床治療提供了新靶標(biāo)和新思路。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文異較大（決定了各受體的特異性），TKD的結(jié)構(gòu)則較為保守。PDGFR、VEGFR、FGFR、Ret和STYK1的TKD在結(jié)構(gòu)上不連續(xù)，由兩個(gè)肽段組成，稱為分裂激酶結(jié)構(gòu)域(SpKinase Domain)（圖1.1）[16]。大部分RTKs的配體為可溶性生長因子，但Eph(ephrin)受體家族的配體為鄰近細(xì)胞表面的膜結(jié)合蛋白ephrin，discoidin受體(DDR)的配體為膠原纖維。

1.2. NRTKs分類與結(jié)構(gòu)示意圖。 NRTKs分為10個(gè)亞家族，由酪氨酸激酶區(qū)和2-4個(gè)組成，各結(jié)構(gòu)域的標(biāo)注見圖下方（http://www.cellbiol.net/ste/bookimages.php）。 腫瘤細(xì)胞中的主要酪氨酸激酶信號(hào)通路TKs與NRTKs的激活方式不同。對(duì)于RTKs而言，配體結(jié)合誘導(dǎo)其形成二聚單體的酪氨酸激酶區(qū)均可使另一單體的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，即交叉磷酸化，使RTKs被激活[14]。NRTKs則通過同源二聚化、與其他蛋白質(zhì)相其他激酶磷酸化等不同方式被激活[15]。氨酸激酶可激活PI3K/Akt、MAPK和JAK/STAT等多種信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞、分化、衰老、凋亡、遷移等具有重要調(diào)節(jié)作用。由獲得性突變、染色體擴(kuò)增導(dǎo)致的RTKs異常激活[14]以及由基因突變、轉(zhuǎn)位、過表達(dá)導(dǎo)致的NRTK15]與人類常見惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相

圖 1.3. PI3K/Akt 信號(hào)通路激活示意圖。磷酸化 RTKs 直接或通過中介蛋白將 PI3K 招募至細(xì)胞膜內(nèi)表面，PI3K 的產(chǎn)物 PIP3 將 Akt 募集至質(zhì)膜處，Ser/Thr 酶 PDK1 與 mTORC2 磷酸化 Akt，使其激活。Akt 通過磷酸化下游信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答。能激活 PI3K/Akt 信號(hào)通路的 RTKs 列于圖左下方的虛線方框內(nèi)[14]。1.2.4 MAPK 信號(hào)通路與前列腺癌MAPK 的全稱是 mitogen-activated protein kinases（絲裂原激活蛋白激酶），MAP信號(hào)通路又叫 RAS-RAF-MEK-ERK 信號(hào)通路，是由 RAF、 MEK1/2、ERK1/2 等激酶組成的一個(gè)級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)，RAS 有三種亞型，分別為 KRAS、HRA和 NRAS，RAS 為小 G 蛋白，與 GDP 結(jié)合時(shí)無活性，GTP 結(jié)合使其轉(zhuǎn)變成活性形式。RAF 有三種組織特異性亞型即 A-RAF、B-RAF 和 C-RAF/RAF-1，又叫 MAPKK(MAP kinase kinase kinase, MAPKKK)，可磷酸化 MEK1/2 (MAP kinase kinase, 又叫MAPKK)，MEK1/2 可磷酸化 ERK1/2 (Mitogen-Activated Protein Kinases, 又叫

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1 馬建宏;曹開源;徐霖;鐘慧玲;張素粉;羅虹嬌;庹玖玲;張?zhí)?劉建中;;前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2015年11期

2 姚

本文編號(hào)：2823609