第一部分高磷誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)膽固醇蓄積目的:慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)患者并發(fā)的動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)性疾病是其最主要的并發(fā)癥和死亡原因。新近研究表明血磷與膽固醇可能具有相似的致動脈粥樣硬化作用。血管平滑肌細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成是動脈粥樣硬化的基本病理過程,為了探討高磷是否通過干擾膽固醇代謝致動脈粥樣硬化的發(fā)生,我們在高磷誘導(dǎo)原代人血管平滑肌細(xì)胞(Vasclar Smooth Muscle Cells,VSMCs)觀察其細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積情況。方法:①建立高磷血癥VSMCs細(xì)胞模型:將6-8代原代人VSMCs分為5組,在2%FBS的M199培養(yǎng)基中饑餓處理24小時,再分別以梯度磷濃度:1.Ommol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L、5.0mmol/L處理24小時后,常規(guī)提取VSMCs總蛋白,以Western blotting法檢測SCAP及HMGCR蛋白的表達(dá)。②將6-8代原代人VSMCs分為對照組及高磷組在常規(guī)饑餓處理后,對照組以磷濃度1.Ommol/L、高磷組以磷濃度3.0mmol/L的2%FBS M199培養(yǎng)基處理24小時后,油紅O染色法觀察VSMCs內(nèi)中性脂質(zhì)蓄積情況,酶法定量法測定VSMCs內(nèi)膽固醇含量,Real time PCR及Western blotting法測定細(xì)胞內(nèi)SCAP、HMGCR和SREBP2 mRNA及其蛋白的表達(dá)。結(jié)果:①通過不同磷濃度梯度干預(yù)VSMCs,Western blotting結(jié)果顯示:磷呈劑量依賴性地上調(diào)VSMCs內(nèi)SCAP及HMGCR蛋白的表達(dá)。②細(xì)胞爬片油紅O染色結(jié)果顯示:高磷組VSMCs內(nèi)中性脂質(zhì)顆粒較對照組明顯增多;酶法定量法測定VSMCs內(nèi)膽固醇含量結(jié)果顯示:高磷組VSMCs內(nèi)總膽固醇及游離膽固醇明顯高于對照組(P0.05);③ Western blotting 結(jié)果顯示:高磷組 SCAP、HMGCR、N-SREBP2蛋白水平明顯高于對照組。Real time PCR結(jié)果顯示:高磷組HMGCR(P0.05)、LDLr(P0.05)及 SREBP2(P0.01)mRNA 的表達(dá)明顯增加。結(jié)論:磷能夠呈劑量依賴性上調(diào)VSMCs內(nèi)SCAP及HMGCR蛋白的表達(dá)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在磷3.0mmol/L條件下,細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集明顯增多,且膽固醇代謝相關(guān)蛋白SCAP、HMGCR、N-SREBP2表達(dá)相應(yīng)升高,其中HMGCR、SREBP2及LDLr基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。而SCAP和N-SREBP2蛋白是細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制(LDLr負(fù)反饋調(diào)節(jié))中的關(guān)鍵蛋白,HMGCR為細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成代謝的限速酶。這些現(xiàn)象提示CKD患者并發(fā)高磷血癥后,高磷通過某種機(jī)制誘導(dǎo)膽固醇代謝紊亂致血管平滑肌細(xì)胞泡沫化,進(jìn)而引發(fā)動脈粥樣硬化性疾病。第二部分高磷誘導(dǎo)膽固醇敏感器SCAP功能失調(diào)促進(jìn)VSMCs泡沫化目的:前期工作中已證實高磷導(dǎo)致的VSMCs內(nèi)膽固醇蓄積可能與SCAP介導(dǎo)的膽固醇穩(wěn)態(tài)負(fù)反饋調(diào)節(jié)失常密切相關(guān)。正常生理狀態(tài)下膽固醇負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)主要通過Insig-SCAP-SREBPs的相互作用實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)平衡。其中SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位至高爾基體是至關(guān)重要的一步,有研究顯示炎癥導(dǎo)致的外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇大量聚集即通過誘導(dǎo)SCAP上調(diào)實現(xiàn)。高磷是否也通過相同的路徑擾亂膽固醇代謝?因此本實驗使用特異性pit1/2通道阻斷劑(PFA)及特異性抑制SCAP由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)位化合物(Betulin),對VSMCs磷的攝取和SCAP轉(zhuǎn)位的水平進(jìn)行干預(yù),進(jìn)一步探究高磷是否在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)SCAP功能失調(diào)致VSMCs泡沫化。方法:將實驗細(xì)胞VSMCs分為6組即:對照組、高磷組、PFA組、PFA+高磷組、Betulin組、Betulin+高磷組。常規(guī)饑餓處理后將分別予以對照組:PBS,高磷組:磷 3.0mmol/L,PFA 組:PFA1.0mmol/L,PFA+高磷組:PFA 1.0mmol/L+磷 3.Ommol/L,Betulin 組:Betulin 3.0μg/mL,Betulin+ 高磷組:Betulin 3.0μg/mL+ 磷 3.Ommol/L 2%FBS M199培養(yǎng)基處理24小時后,用油紅O染色法檢測VSMCs內(nèi)中性脂質(zhì)顆粒聚集情況;以酶法定量法檢測VSMCs內(nèi)膽固醇含量;Realtime PCR 檢測 VSMCs 內(nèi) HMGCR、LDLr、SREBP2 以及 SCAP mRNA 的表達(dá)。結(jié)果:油紅O結(jié)果顯示:PFA組與對照組VSNCs內(nèi)中性脂質(zhì)顆粒無明顯差異,而PFA+高磷組相較于高磷組其VSMCs內(nèi)的中性脂質(zhì)顆粒明顯減少。Betulin組VSMCs內(nèi)的中性脂質(zhì)顆粒聚集程度與對照組相似,Betulin+高磷組VSMCs內(nèi)的中性脂質(zhì)顆粒明顯少于高磷組。酶法定量結(jié)果顯示:PFA組與對照組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義,PFA+高磷組細(xì)胞內(nèi)膽固醇較高磷組明顯減少(總膽固醇及游離膽固醇均P0.05)。Betulin組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量較對照組明顯減少(總膽固醇P0.05;游離膽固醇P0.01);Betulin+高磷組較高磷組細(xì)胞內(nèi)膽固醇也明顯減少(總膽固醇及游離膽固醇均P0.05)。Real time PCR 結(jié)果顯示:高磷+PFA 組 HMGCR、LDLr 及 SREBP2 mRNA表達(dá)明顯低于高磷組(均P0.05);Betulin組HMGCR、LDLr mRNA表達(dá)較對照組明顯降低(P0.05);高磷+Betulin組HMGCR、LDLr及SREBP2 mRNA表達(dá)與高磷組相比明顯降低(HMGCR及LDLrP0.01;SREBP2 P0.05)。SCAP 在 PFA 或者 Betulin 作用下其mRNA無明顯變化。結(jié)論:高磷狀態(tài)下PFA阻斷磷進(jìn)入細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)膽固醇明顯減少,這說明高磷狀態(tài)下磷需進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能實現(xiàn)對膽固醇代謝的干擾作用。SCAP轉(zhuǎn)位過程被抑制后,高磷引起的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量蓄積被明顯削弱,這一現(xiàn)象說明高磷通過干擾SCAP的功能,從而引起VSMCs泡沫化。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

ＶＳＭＣｓ內(nèi)中性脂質(zhì)顆粒分布密度與對照組無明顯差異，而高磷條件下加逡逑入ＰＦＡ干預(yù)后，原高磷條件下細(xì)胞內(nèi)大量聚集中性脂質(zhì)的情況消失，紅色顆粒變逡逑得又小又稀少。（如圖２ａ）。逡逑＂ｉ邋＼邐．逡逑、：，‘邐、＇ｋ、八ｒ邐，一邋１邐＇邐＊？．．，逡逑？邋＊邐＇邋ｉ邐Ｉ邋＜邐Ａ邐“逡逑Ｃｔｒｌ邐Ｐ邐ＰＦＡ邐Ｐ＋ＰＦＡ逡逑圖２ａ？高磷＋ＰＦＡ干預(yù)原代人ＶＳＭＣｓ油紅Ｏ染色結(jié)果（ｘ２００）逡逑ｒｉｇ，２ａ．邋Ｏｉｌ邋ｒｅｄ邋Ｏ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｈｉｇｈ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ邋＋邋ＰＦＡ邋ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｈｕｍａｎ逡逑ＶＳＭＣｓ邋（ｘ２００）逡逑在含抗氧化劑ＥＤＴＡ邋（１００嘩ｏｉ／Ｌ）、丁羥甲苯ＱＯｐｍｏＩ／Ｌ）和２％ＦＢＳ的逡逑Ｍ１９９培養(yǎng)基中饑餓處理原代人ＶＳＭＣｓ細(xì)胞爬片２４小時，使用ＰＢＳ邋（對照組）、逡逑磷邋３．０ｍｍｏｌ／Ｌ邋（高磷組）、ＰＦＡ１．０ｍｍｏｌ／Ｌ邋和磷邋３．０ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＰＦＡ１．０ｍｍｏｌ／Ｌ邋處理邋２４逡逑小時。細(xì)胞用４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ，油紅０染色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察（ｘ２００）。逡逑４．２高磷ＰＦＡ干預(yù)ＶＳＭＣｓ后細(xì)胞內(nèi)膽固醇測定逡逑在正常磷水平下利用ＰＦＡ處理ＶＳＭＣｓ后，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量與對照組相比逡逑無明顯差異（Ｐ＞0．0５）

高磷條件下使用Ｂｅｔｕｌｉｎ后，高磷誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)蓄積現(xiàn)象被明顯削逡逑弱。且在磷離子水平正常情況下，Ｂｅｔｕｌｉｎ對細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)顆粒蓄積無明顯影響。逡逑使用Ｂｅｔｕｌｉｎ前后中性脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布區(qū)域一致（如圖２ｄ）。逡逑＇、？邋Ｖ邋１邋ｉｉ邐＊邋ｒ邋＇邋？邋？邐｜．邋，邐＼邐＊邋＊逡逑，、＃邐０邋ｊ邋，邋廣邋“Ｉ邋（、邐’邐？逡逑ｉ＇邋＾邐■邐一身？邋－邐、、邐？邐，，邐４邐－逡逑Ｖ邐＊邐＾邐＂邋ｒ邐鍪邐．？邐，／邋：邐＊邐＼逡逑，０邐－邋＾邐－邐＊邋１邐＊邐．N

本文編號：2823354