【摘要】：目的:檢測(cè)在前列腺癌中NOP16的表達(dá)水平,下調(diào)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)的NOP16水平后對(duì)前列腺癌細(xì)胞形態(tài)、總蛋白濃度以及體外生物學(xué)行為的影響;下調(diào)與NOP16體內(nèi)結(jié)合的蛋白復(fù)合體后對(duì)NOP16功能的影響;進(jìn)一步探討降低前列腺癌細(xì)胞中NOP16水平后對(duì)核糖體生物合成的影響并初步探討機(jī)制。方法:首先檢測(cè)NOP16分別在前列腺增生組織以及前列腺癌組織中以及細(xì)胞中表達(dá)水平是否存在差異,接著運(yùn)用特異性siRNA敲低NOP16細(xì)胞內(nèi)源性水平,并運(yùn)用Western Blot、RT-qPCR驗(yàn)證是否敲低成功;運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低前列腺癌PC3細(xì)胞中NOP16水平是否會(huì)對(duì)影響細(xì)胞增殖,運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低前列腺癌細(xì)胞中的NOP16水平表達(dá)是否會(huì)對(duì)細(xì)胞體外遷移產(chǎn)生影響,運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低前列腺癌細(xì)胞中的NOP16水平表達(dá)是否會(huì)對(duì)細(xì)胞體外侵襲產(chǎn)生影響。運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、質(zhì)譜分析和免疫共沉淀尋找與NOP16相互結(jié)合的蛋白并使用RT-qPCR及Western-Blot方法驗(yàn)證,運(yùn)用特異性siRNA對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞系內(nèi)NOP16及相結(jié)合蛋白基因分別和共同敲低,對(duì)比各組細(xì)胞體外行為學(xué)差異,最后運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)18S和28SrRNA的差異。結(jié)果:前列腺癌組織中NOP16明顯高于前列腺增生組織;利用NOP16 siRNA對(duì)PC3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染降低細(xì)胞內(nèi)源性NOP16的表達(dá)后,前列腺癌細(xì)胞體積變小,細(xì)胞總蛋白濃度降低,前列腺癌的細(xì)胞體外增殖、侵襲及遷移均得到抑制;聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、質(zhì)譜分析和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)篩選出可以在細(xì)胞內(nèi)和NOP16相結(jié)合的蛋白hnRNPM,降低hnRNPM蛋白表達(dá)后,可以促進(jìn)前列腺癌PC3細(xì)胞的體外侵襲和遷移,但不影響其增殖。運(yùn)用特異性SiRNA對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞系內(nèi)NOP16進(jìn)行敲低后,細(xì)胞內(nèi)18S和28SrRNA明顯減少。結(jié)論:前列腺癌細(xì)胞內(nèi)NOP16低表達(dá)可使前列腺癌細(xì)胞體積大小、總蛋白濃度發(fā)生變化,同時(shí)前列腺癌細(xì)胞的體外生物學(xué)行為增殖、遷移、侵襲均會(huì)發(fā)生改變,并且細(xì)胞內(nèi)核糖體大小亞基同時(shí)隨NOP16的變化發(fā)生變化;異常表達(dá)和NOP16在前列腺癌細(xì)胞內(nèi)相結(jié)合的蛋白hnRNPM后,前列腺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲發(fā)生改變,但其增殖變化卻不明顯。因此我們認(rèn)為,NOP16的表達(dá)可影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展,且能與hnRNPM互相結(jié)合,敲低NOP16后可影響hnRNPM在前列腺癌中的作用,而且其是通過核糖體的應(yīng)激影響前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

別從臨床上收集到的人前列腺增生組織和前列腺癌組織進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄及RT -qPCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NOP16在前列腺癌組織中高表達(dá)于前列腺增生組織（詳見圖1）。圖 1 前列腺增生和 PCa 組織中 NOP16 的 mRNA 的表達(dá)差異2.2 NOP16在細(xì)胞水平時(shí)前列腺癌高于正常前列腺上皮除組織之間的對(duì)比，另外我們也通過細(xì)胞水平比較了人的正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1和人前列腺癌細(xì)胞系PC3中的NOP16的表達(dá)量。我們分別從上述兩種細(xì)胞系中提取總蛋白和RNA，并對(duì)提取的蛋白進(jìn)行Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和正常的人正常前列腺上皮細(xì)胞相比，NOP16的蛋白表達(dá)水平和mRNA水平在PC3細(xì)胞系中高表達(dá)（如圖2所示）。

提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和正常的人正常前列腺上皮細(xì)胞相比，NOP16的蛋白表達(dá)水平和mRNA水平在PC3細(xì)胞系中高表達(dá)（如圖2所示）。

我們分別將特異性NOP16敲低的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)PC3細(xì)胞中，比較siRNA組、對(duì)照組Control組的內(nèi)源性NOP16的表達(dá)水平，結(jié)果顯示siRNA組的NOP16在蛋白和mRNA水平的表達(dá)量顯著降低（如圖3所示）。收集同步培養(yǎng)的細(xì)胞（siRNA組和Control組），且使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器收集相同數(shù)目的細(xì)胞后對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，了解兩組細(xì)胞處理后各組的蛋白總濃度的差異。結(jié)果顯示，經(jīng)過NOP16siRNA敲低后的細(xì)胞組的總蛋白濃度表達(dá)量明顯低于對(duì)照組的總蛋白濃度表達(dá)量，并且經(jīng)過分析后顯示兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（n=3，p＜0.05）值得一提的是，在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在siRNA處理組的細(xì)胞體積相對(duì)于對(duì)照的Control組變小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=80,p<0.05）（如圖4所示）。圖 3 構(gòu)建 NOP16 敲低前列腺癌 PC3 細(xì)胞

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1 馬建宏;曹開源;徐霖;鐘慧玲;張素粉;羅虹嬌;庹玖玲;張?zhí)?劉建中;;前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2015年11期

2 姚

本文編號(hào)：2788052