【摘要】：目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是危害人類健康的主要疾病,近年來,其發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升趨勢。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最重要的微血管并發(fā)癥之一,并且嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量。Corin是一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,主要特異性表達(dá)于心臟,但在腎臟、子宮、胎盤、骨等多組織系統(tǒng)也有Corin的表達(dá)。Corin能切割心房鈉尿肽前體(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP),并將其活化為心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),產(chǎn)生的ANP具有生物學(xué)活性。有研究表明,Corin可參與多種腎臟疾病的發(fā)生。在慢性腎病患者中,尿Corin水平與腎臟Corin表達(dá)水平均明顯下降;在伴有蛋白尿的腎臟疾病中,Corin水平下降可引起水鈉潴留。在腎病綜合征大鼠動(dòng)物模型及Corin基因敲除小鼠中均可見Corin水平下降可引起水鈉潴留。但是,Corin在糖尿病腎病發(fā)病中的作用尚未闡明。因此,本文旨在通過高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞株,采用si RNA技術(shù)、Real-time PCR、RT-PCR、Western blot以及免疫熒光等相關(guān)細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù),探討Corin在糖尿病腎病中的作用,以期闡明糖尿病腎病發(fā)病的新的分子機(jī)制并發(fā)現(xiàn)防治新靶點(diǎn)。方法1.RT-PCR檢測高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞株Corin和ANP m RNA水平的表達(dá),并以高滲透壓組(OC)及正常濃度糖對照組(Ctrl)為對照。2.Western blot檢測高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞株Corin和ANP蛋白的表達(dá),并以O(shè)C組及Ctrl組為對照。3.免疫熒光染色方法檢測高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞株Corin表達(dá)水平,并以O(shè)C組及Ctrl組為對照。。4.構(gòu)建Corin-si RNA HK-2細(xì)胞,RT-PCR鑒定Corin-si RNA的HK-2細(xì)胞Corin基因干擾效率。5.Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證Corin-si RNA的HK-2細(xì)胞Corin基因干擾效率。6.普通光學(xué)顯微鏡下觀察Corin-si RNA HK-2細(xì)胞的增殖情況。7.MTT比色法與臺盼藍(lán)染色方法檢測Corin-si RNA HK-2細(xì)胞的增殖情況與活力。8.內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Corin-si RNA HK-2細(xì)胞上清液對EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)的影響。結(jié)果1.高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞株Corin及ANP m RNA表達(dá)水平與Ctrl、OC組相比均降低。2.高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞株Corin和ANP蛋白表達(dá)水平與Ctrl、OC組相比均降低。3.免疫熒光染色(IF)結(jié)果表明,與Ctrl、OC組相比,高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞株Corin表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。4.導(dǎo)入HK-2細(xì)胞中的Corin-si RNA序列1和序列2對Corin基因的干擾效率分別為45.45%、44.18%(P0.01)。5.與NC-si RNA組相比較,導(dǎo)入Corin-si RNA序列1和序列2的HK-2細(xì)胞Corin蛋白水平表達(dá)均明顯下降。6.與NC-si RNA組比較,Corin-si RNA HK-2細(xì)胞的增殖均明顯被抑制。7.與NC-si RNA組比較,Corin-si RNA HK-2細(xì)胞增殖能力明顯下降(P0.01),Corin-si RNA HK-2細(xì)胞活力亦明顯降低(P0.01)。8.與Ctrl和NC-si RNA組比較,Corin-si RNA HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清使EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞受損后修復(fù)能力受損。結(jié)論1.成功構(gòu)建了Corin缺失的HK-2細(xì)胞模型;2.Corin和ANP對腎臟具有保護(hù)性作用;3.HK-2細(xì)胞Corin缺陷影響EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)功能;4.Corin缺失參與了糖尿病腎病的內(nèi)皮功能紊亂的發(fā)生;5.在糖尿病腎病中Corin介導(dǎo)的pro-ANP活化途徑十分重要。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R692.9
【圖文】：

Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族結(jié)構(gòu)圖。Zhang Y, Li H, Zts, 2014, 4: 7378.白結(jié)構(gòu)域模式圖。蛋白酶催化區(qū)（Protease）包括組和絲氨酸（S）的殘基，按順序排列；清道夫受體樣低密度脂蛋白受體重復(fù)序列（LDLR）；富含半胱氨跨膜區(qū)（TM）。Wu Q, Xu-Cai YO, Chen S, et09, 75(2): 142-146.疾病中的研究現(xiàn)狀物學(xué)功能是活化 pro-ANP 生成活性的 ANP【75】。Cor達(dá)，研究表明在心臟、腎臟、子宮、胎盤、骨等多

圖 2：Corin 的蛋白結(jié)構(gòu)域模式圖。蛋白酶催化區(qū)（Protease）包括組氨酸（H）、天冬氨酸（D）和絲氨酸（S）的殘基，按順序排列；清道夫受體樣半胱氨酸富集區(qū)域（SR）；低密度脂蛋白受體重復(fù)序列（LDLR）；富含半胱氨酸的卷曲狀區(qū)域（Fz）；跨膜區(qū)（TM）。Wu Q, Xu-Cai YO, Chen S, et al. KidneyInternational, 2009, 75(2): 142-146.3.2 Corin 在臨床疾病中的研究現(xiàn)狀Corin 的生物學(xué)功能是活化 pro-ANP 生成活性的 ANP【75】。Corin 在多種組織器官中都有表達(dá)，研究表明在心臟、腎臟、子宮、胎盤、骨等多系統(tǒng)均發(fā)現(xiàn)有 Corin 的表達(dá)【76】。Corin 敲除小鼠動(dòng)物模型與野生型小鼠相比較，pro-ANP 水平更高，但檢測不到成熟活性的 ANP，當(dāng)注入活性重組可溶性 Corin 后可以瞬間恢復(fù)對 pro-ANP 的加工，并且 Corin 敲除小鼠動(dòng)物模型更容易發(fā)生水鈉潴留以及晚期妊娠蛋白尿等疾病，說明 Corin 介導(dǎo)的 pro-ANP 活化途徑在維持水鈉平衡和腎臟功能中發(fā)揮重要作用【84, 85】。Corin 介導(dǎo) pro-ANP 活化的通路，對維持正常腎臟功能必不可少（如圖 3a 所示），當(dāng) Corin 介導(dǎo) pro-ANP 的活化下降時(shí)，

則會通過一系列信號通路導(dǎo)致腎臟水鈉潴留，引起腎病綜合征（如圖 3b 所示）；在正常腎臟中，產(chǎn)生于腎臟的 Corin，將 pro-ANP 轉(zhuǎn)化為具有活性的 ANP，ANP與其受體 NPR-A 結(jié)合后可活化鳥苷酸環(huán)化酶（GC-A），GC-A 可催化并水解GTP 形成 cGMP，cGMP 的功能為：促進(jìn)腎小球入球血管舒張和出球血管收縮來增加腎小球?yàn)V過、促進(jìn)水通道蛋白 2（AQP2）從頂膜的釋放、抑制上皮鈉通道ENaC 的活性、活化 cGMP-依賴性蛋白激酶 2（PKGⅡ）進(jìn)而降低腎素的釋放、結(jié)合并活化磷酸二酯酶 5（PDE5）進(jìn)而反饋抑制 cGMP，綜上所述，Corin 在正常腎臟中發(fā)揮利鈉和利尿的作用；在腎病綜合征中，腎臟 Corin 表達(dá)下降，導(dǎo)致將 pro-ANP 活化為 ANP 減少，降低的 ANP 進(jìn)而引起 cGMP 產(chǎn)生減少，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率下降、AQP2 升高、ENaC 升高、PKG 升高、PDE5 以及磷酸化 PDE5（pPDE5）升高，最終引起水鈉潴留【59】。因此，Corin 參與了腎臟疾病發(fā)病以及進(jìn)展，Corin 可能作為腎臟疾病的生物標(biāo)志物。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 方朝東;董寧征;;絲氨酸蛋白酶-Corin與心血管疾病[J];國際心血管病雜志;2011年02期

本文編號：2786433