【摘要】：背景衰老(aging)是一個隨著時間增長,在機體的分子、細胞、組織、器官和系統(tǒng)各個水平中發(fā)生的不可逆的變化過程。在衰老的過程中,有相當(dāng)比例的男性隨著年齡的增長逐漸出現(xiàn)睪丸內(nèi)分泌功能減退,體內(nèi)雄激素水平的下降,患者出現(xiàn)性欲減退、勃起功能障礙、勞動耐力下降、骨質(zhì)疏松、體脂增加、認知功能和記憶力下降,稱為男性遲發(fā)型性腺功能減退(LOH),這嚴(yán)重影響了該類患者的生活水平和質(zhì)量。男性性腺功能的下降與生殖系統(tǒng)內(nèi)氧化應(yīng)激損傷加重,抗氧化能力下降密切相關(guān),已成為目前研究熱點。維生素D3與男性生殖關(guān)系密切。大量研究證實,維生素D受體(VDR)及維生素代謝酶被發(fā)現(xiàn)存在于睪丸間質(zhì)細胞、支持細胞、生殖細胞、精子及男性生殖道上皮中。多項臨床研究揭示,血清25(OH)D水平與體內(nèi)總睪酮和游離睪酮呈正相關(guān)。對于VDR缺失的裸鼠,精子數(shù)量和活力明顯降低,從而導(dǎo)致不育。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路是機體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,Nrf2轉(zhuǎn)位進入細胞核內(nèi),識別抗氧化反應(yīng)原件(ARE),進而啟動下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控II相代謝酶、抗氧化酶,如谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)、超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素加氧酶1(HO-1)、葡糖糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A6(NQO1)等的轉(zhuǎn)錄活性,從而發(fā)揮抗氧化損傷的作用。研究顯示,Nrf2基因敲除的小鼠加速了年齡相關(guān)的精子生成障礙及睪酮水平的降低,提示Nrf2在機體生殖系統(tǒng)氧化損傷中的關(guān)鍵作用。研究顯示,維生素D可激活Nrf2通路,延緩糖尿病腎病、支氣管哮喘等多種疾病引起的氧化應(yīng)激損傷。綜上所述,維生素D是否也可通過激活睪丸組織Nrf2-ARE通路,加強Nrf2作用,進而調(diào)節(jié)下游抗氧化蛋白的表達,改善老年大鼠睪丸功能減退?本研究通過D-半乳糖(D-gal)皮下注射構(gòu)建大鼠亞急性衰老模型,分別予不同劑量的維生素D處理,旨在研究活性維生素D對老年大鼠睪丸功能及氧化應(yīng)激水平的影響,并探究其是否通過Nrf2/ARE通路發(fā)揮作用。目的觀察活性維生素D對亞急性衰老大鼠睪丸功能的影響,并初步探究活性維生素D與睪丸氧化應(yīng)激損傷的關(guān)系。方法8周齡雄性SD大鼠,隨機分為兩組,一組連續(xù)8周頸背部皮下注射15%D-半乳糖溶液500mg/(kg*d)制造亞急性衰老模型,另一組皮下注射等劑量的生理鹽水作為正常對照。將造模成功后的亞急性衰老模型大鼠隨機分為衰老模型組(DG)、衰老+低劑量維生素D組(LD)、衰老+高劑量維生素D組(HD),將正常對照組隨機分為正常對照組(NC)、正常+低劑量維生素D組(LC)、正常+高劑量維生素D組(HC)。LD組、LC組予骨化三醇0.025ug/(kg*d)溶于花生油灌胃,HD組、HC組予骨化三醇0.1ug/(kg*d)溶于花生油灌胃,DG組、NC組予等量的花生油作為對照。8周后處死大鼠,分別稱量體重、睪丸重量;取靜脈血行生化、性激素檢測;取大鼠附睪行精子參數(shù)分析;分光光度計法檢測睪丸組織SOD、MDA含量;Western Blot檢測睪丸組織VDR、Nrf2、GCLC、SOD2蛋白的表達;實時熒光定量PCR檢測Nrf2 mRNA的表達;大鼠睪丸組織中性甲醛固定后行HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化,免疫組化、免疫熒光檢測VDR、Nrf2蛋白的表達及定位。結(jié)果1.亞急性衰老模型的評價與正常對照組相比,衰老模型組在注射D-半乳糖溶液后逐漸出現(xiàn)行動遲緩,毛發(fā)發(fā)黃,且褪毛嚴(yán)重。注射D-半乳糖溶液8周后,處死大鼠,可觀察到胸腺指數(shù)、肝臟指數(shù)較正常對照組下降。睪丸指數(shù)下降,血睪酮水平降低。2.活性維生素D對各組大鼠一般情況及睪酮水平的影響DG組與NC組相比,睪丸重量明顯下降(P0.05),睪丸指數(shù)(睪丸重量/體重)下降(P0.05)。補充維生素D之后可見,LD組和HD組睪丸重量和睪丸指數(shù)較DG組有所增加(P0.05)。LD組和HD組,LC組和HC組,各組間睪丸重量以及睪丸指數(shù)未見差異(P0.05)。各組間體重未見明顯差異(P0.05)。與NC組相比,DG組睪酮顯著下降(P0.05),補充維生素D后可見HD和LD組,睪酮水平有所增加(P0.05)。DG組血鈣水平較NC組無明顯差異(P0.05),LD組及HD組較DG組血鈣水平升高,LC組和HC組較NC組血鈣水平升高(P0.05)。血磷水平各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.活性維生素D對各組大鼠精子參數(shù)的比較與NC組相比,DG組精子總數(shù)以及精子活動度下降(P0.05),補充維生素D后可見精子總數(shù)增加,活精子數(shù)增加(P0.05)。4.活性維生素D對各組大鼠睪丸組織SOD及MDA的影響與NC組相比,DG組SOD酶活力下降(P0.05),補充維生素D后可見SOD酶活力增強(P0.05)。與NC組相比,DG組MDA含量增加(P0.05),補充活性維生素D后可見MDA含量下降(P0.05)。5.活性維生素D對各組大鼠睪丸結(jié)構(gòu)的比較HE染色可見,DG組大鼠睪丸組織生精小管萎縮,細胞層數(shù)減少,曲細精管管徑縮小,管間間隙增寬,管內(nèi)精子數(shù)目較少,間質(zhì)區(qū)可見睪丸間質(zhì)細胞稀少,間質(zhì)增生。NC組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)完整,曲細精管飽滿,管壁厚,生精細胞排列有序,管間含有豐富的精子。6.活性維生素D對各組大鼠睪丸組織Nrf2 mRNA的影響PT-PCR結(jié)果顯示,與NC組相比,DG組Nrf2 mRNA表達水平下降(P0.05),補充維生素D后,可見LD組、HD組Nrf2 mRNA表達水平上升(P0.05);LC組、HC組Nrf2 mRNA水平較NC組上升(P0.05)。7.活性維生素D對各組大鼠睪丸組織VDR、Nrf2、SOD2、GCLC蛋白的比較與NC組相比,DG組Nrf2、SOD2、GCLC蛋白水平下降(P0.05),補充維生素D后可見LD組、HD組VDR、Nrf2、SOD2、GCLC蛋白水平較DG組上升(P0.05)。8.各組大鼠睪丸組織VDR、Nrf2的表達及定位的比較免疫組化及熒光結(jié)果顯示,VDR、Nrf2均表達于各組精細胞及精子中,細胞核和細胞漿中均有表達。與NC組相比,DG組睪丸組織中VDR、Nrf2蛋白表達下降,補充維生素D后可見,LD組、HD組睪丸組織VDR、Nrf2蛋白升高。結(jié)論活性維生素D可改善D-半乳糖誘導(dǎo)的老年雄性大鼠睪丸功能減退。其機制可能是通過增強Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激水平來實現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R697.22
【圖文】：

圖 1 活性維生素 D 對各組大鼠精子參數(shù)的比較與衰老模型組相比，*P<0.05，與正常對照組相比，#P<0.05A B圖 2 各組大鼠氧化應(yīng)激水平的比較與衰老模型組相比，*P<0.05，與正常對照組相比，#P<0.05

各組大鼠氧化應(yīng)激水平的比較

各組大鼠睪丸組織HE染色結(jié)果（×100）

【參考文獻】

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1 劉太華;楊瑞峰;孔祥斌;陳耀平;李紅鋼;章慧平;夏偉;官黃濤;谷翊群;商學(xué)軍;周遠忠;吳偉雄;熊承良;;不同年齡段男性血清總睪酮和游離睪酮水平分析[J];中國計劃生育和婦產(chǎn)科;2014年09期

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1 趙秀軍;氧化應(yīng)激和慢性炎癥影響睪丸間質(zhì)細胞衰老的作用機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2781455