【摘要】：【研究背景】腎細(xì)胞癌(RCC)是成人中最常見的腎惡性腫瘤,5年生存率為50-69%。而轉(zhuǎn)移性RCC患者的中位生存期為13個(gè)月。瞬時(shí)受體電位通道7(TRPM7)是一種廣泛表達(dá)的具有內(nèi)在激酶活性的離子通道。大量綜述揭示了TRPM7通道激酶在細(xì)胞基本過程、生理反應(yīng)和胚胎發(fā)育中的重要作用。越來越多的證據(jù)表明TRPM7在包括癌癥在內(nèi)的人類疾病中有異常的表達(dá)和/或激活,并在癌細(xì)胞的生存、細(xì)胞周期進(jìn)程、增殖、生長、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著多種功能作用。在最近的研究中,TRPM7被確認(rèn)為PI3K/AKT、MAPK、ERK 1/2通路的調(diào)節(jié)因子,調(diào)控多種癌基因調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞周期基因,其功能可能與人結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、鼻咽癌和食管鱗狀細(xì)胞癌等多種人類癌癥有關(guān)。截至目前,尚無關(guān)于TRPM7和RCC的相關(guān)性的報(bào)道。本研究旨在通過體外細(xì)胞試驗(yàn)和體內(nèi)小鼠模型探討TRPM7在RCC中的調(diào)控作用和機(jī)制,及其信號(hào)通路。【研究目的】探討TRPM7在RCC中的表達(dá)及調(diào)控作用,進(jìn)一步探討其信號(hào)通路�！狙芯糠椒ā�1).通過Western blot及Q-PCR檢測(cè)體外HK-2細(xì)胞及RCC細(xì)胞的TRPM7表達(dá)水平,提出假設(shè)。2).功能研究:(1).在人類RCC細(xì)胞中沉默或過表達(dá)TRPM7,在體外培養(yǎng)觀察TRPM7在RCC細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)RCC細(xì)胞的活力及增殖能力的影響。(2).通過將沉默TRPM7的RCC細(xì)胞和對(duì)照組RCC細(xì)胞皮下注射到裸鼠的背側(cè),建立異種移植腫瘤模型,進(jìn)一步探討TRPM7在體內(nèi)對(duì)RCC腫瘤增殖及生長的作用。3).機(jī)制研究:在RCC細(xì)胞中沉默或過表達(dá)TRPM7和/或FOXO1,同時(shí)加入AKT抑制劑處理,檢測(cè)轉(zhuǎn)染后RCC細(xì)胞的p-AKT,AKT,p-FOXO1及FOXO1表達(dá)情況,以及各自處理對(duì)RCC細(xì)胞的活性及增殖能力的影響,探討TRPM7、PI3K/AKT信號(hào)通路及FOXO1在RCC發(fā)生及進(jìn)展中的相互關(guān)系�！狙芯拷Y(jié)果】1).TRPM7在RCC細(xì)胞中高表達(dá)與正常腎上皮HK-2細(xì)胞相比,4種RCC細(xì)胞的TRPM7表達(dá)水平顯著升高。2).TRPM7增強(qiáng)體內(nèi)外RCC細(xì)胞的活性及增殖能力(1).體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比,沉默TRPM7的RCC細(xì)胞的活性及增殖能力明顯減弱,而TRPM7過表達(dá)的RCC細(xì)胞的活性及增殖能力則明顯增強(qiáng)。(2).小鼠體內(nèi)異種移植腫瘤模型實(shí)驗(yàn):注射沉默TRPM7的RCC細(xì)胞的瘤體生長速度明顯慢于對(duì)照組(P0.001),瘤體的體積明顯小于對(duì)照組(P0.001),瘤體的平均重量也明顯低于對(duì)照組(P0.001)。3).TRPM7通過激活A(yù)KT信號(hào)通路抑制FOXO1轉(zhuǎn)錄活性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖生長磷酸化的FOXO1在TRPM7沉默的RCC細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低。此外,免疫熒光試驗(yàn)顯示,沉默TRPM7后,FOXO1的細(xì)胞定位從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,提示沉默TRPM7可以激活FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性。已知AKT激酶在磷酸化和抑制FOXO1轉(zhuǎn)錄活性方面起著關(guān)鍵作用。正如預(yù)測(cè)的那樣,沉默TRPM7降低了磷酸化AKT的表達(dá)水平,提示TRPM7是通過激活A(yù)KT信號(hào)通路而抑制FOXO1的活性。為了證實(shí)這些結(jié)果,我們?cè)赗CC細(xì)胞中過表達(dá)TRPM7,并用AKT抑制劑(Ly294002)處理,磷酸化AKT和磷酸化FOXO1的表達(dá)水平顯著降低,而FOXO1的表達(dá)水平增高。細(xì)胞增殖和克隆形成試驗(yàn)表明,和對(duì)照組細(xì)胞相比,AKT抑制劑處理后的TRPM7過表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力明顯減弱。此外,細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示沉默F(xiàn)OXO1可顯著降低沉默TRPM7對(duì)細(xì)胞活力和增殖能力的抑制作用,提示FOXO1在RCC細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要的下游調(diào)控作用。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明TRPM7可能部分通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路,而抑制FOXO1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄能力,從而促進(jìn)RCC細(xì)胞的增殖生長。【結(jié)論】我們的結(jié)果提示TRPM7在RCC的發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,其是通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路,而抑制FOXO1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄能力,從而促進(jìn)RCC細(xì)胞的增殖生長。這些發(fā)現(xiàn)提示TRPM7在人腎癌的發(fā)生、進(jìn)展中起著重要的作用,使TRPM7可能成為RCC的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.11
【圖文】：

TRPM75’-CCATACCATATTCTCCAAGGTTCC-3’5G1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.2.1 TRPM7 在 RCC 細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯增大量已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)表明 TRPM7 在人類多種腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、鼻咽癌和食管和/或激活，截至目前，尚無關(guān)于 TRPM7 和 RWestern blot 和 Q-PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 TRPM7 在（786-O,A498,OSRC-2,ACHN）的表達(dá)水平，圖HK-2 細(xì)胞相比，4 種 RCC 細(xì)胞（786-O,A498,OS和蛋白表達(dá)水平顯著升高。

圖 2-1 沉默 TRPM7 對(duì) RCC 細(xì)胞增殖生長能力的影響圖2-2 過表達(dá)TRPM7對(duì)RCC細(xì) 600800vity(A490)ACHNsh-TRPM7- #1***Scramsh-TRPM7- #2400600800activity(A490)OSRC-2sh-TRPM7- #1***Scramsh-TRPM7- #2

28圖 2-1 沉默 TRPM7 對(duì) RCC 細(xì)胞增殖生長能力的影響圖2-2 過表達(dá)TRPM7對(duì)RCC細(xì) 胞增殖生長能力的影響圖 2-3 沉默或過表達(dá) TRPM7 對(duì) RCC 細(xì)胞增殖生長能力的影響2.2.2 TRPM7 促進(jìn)小鼠異種移植瘤（RCC）的增殖和生長本課題第一、二部分分別在細(xì)胞水平上證實(shí)了 TRPM7 在 RCC 的發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，為進(jìn)一步證實(shí) TRPM7 在動(dòng)物水平上也具有促進(jìn) RCC 增殖生長的作用，本課題通過將沉默 TRPM7 的 OSRC-2 細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞皮下注射到裸鼠的背側(cè)，建立異種移植腫瘤模型，進(jìn)一步探討 TRPM7 對(duì)ACHN OSRC-20.00.51.01.5Relativecolonyn

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