【摘要】：第一章 緒論2008年夏發(fā)生的三聚氰胺毒奶粉事件是我國(guó)食品安全的一次災(zāi)難性的事件。盡管三聚氰胺毒奶粉事件已過去4年,但三聚氰胺如何引發(fā)患兒這種特殊尿路結(jié)石的機(jī)制仍未徹底闡明；除三聚氰胺外,結(jié)石的形成是否還涉及其他因素至今尚不清楚。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),三聚氰胺不僅可引發(fā)的泌尿系結(jié)石,而且還可能導(dǎo)致慢性腎損傷和膀胱癌。那么,在將來這些結(jié)石患兒這些病患風(fēng)險(xiǎn)程度所知甚少,以及這些風(fēng)險(xiǎn)是否可控目前無人研究。對(duì)此,本論文將研究三聚氰胺引發(fā)嬰幼兒泌尿系結(jié)石的形成機(jī)制,特別是這種特殊結(jié)石的形成是否涉及三聚氰胺之外的因素；三聚氰胺本身對(duì)腎臟和膀胱器官細(xì)胞的毒性作用；三聚氰胺引發(fā)腎損傷及膀胱癌的病變特征,特別是膀胱癌及相應(yīng)的防治措施。頭孢曲松泌尿系結(jié)石的臨床報(bào)道非常罕見,但近期我院于1月內(nèi)連續(xù)收到2例頭孢曲松鈉引發(fā)的兒童尿路結(jié)石。這使我們產(chǎn)生了對(duì)頭孢曲松鈉藥品安全性的擔(dān)心。對(duì)此,我們立即對(duì)該類結(jié)石的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,以及通過體外實(shí)驗(yàn)的方法初步探討了該類結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)因素。由于頭孢曲松鈉與三聚氰胺均屬于促進(jìn)結(jié)石形成的外源性化合物,本課題也將附上這一章節(jié)。第二章 三聚氰胺結(jié)石成分的檢測(cè)方法第一節(jié) 三聚氰胺結(jié)石的紅外光譜定性分析目的：利用紅外光譜定性分析三聚氰胺引發(fā)的嬰幼兒泌尿系結(jié)石的成分。方法：首先利用三聚氰胺、三聚氰酸及尿酸在水溶液中分別制備三聚氰胺-三聚氰酸沉淀和三聚氰胺-尿酸沉淀。然后通過紅外光譜分別檢測(cè)三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸、三聚氰胺-三聚氰酸混合物(1：1摩爾比混合)、三聚氰胺-尿酸混合物(1：1摩爾比混合)、三聚氰胺-三聚氰酸復(fù)合物、三聚氰胺-尿酸復(fù)合物、以及一例嬰幼兒三聚氰胺結(jié)石樣本。對(duì)以上樣本紅外光譜圖的典型峰位進(jìn)行分析和比較。結(jié)果：三聚氰胺-三聚氰酸混合物和三聚氰胺-尿酸混合物的紅外光譜峰位基本是兩種混合物中各自化合物紅外光譜峰位的集合。三聚氰胺-三聚氰酸沉淀物和三聚氰胺-三聚氰酸沉淀物的紅外光譜峰位與之不同,三聚氰胺的典型峰位在在這兩種沉淀物的譜圖中均消失。1例三聚氰胺引發(fā)的兒童尿路結(jié)石的紅外光譜典型峰位與三聚氰胺-尿酸沉淀物的紅外光譜典型峰位基本相似。結(jié)論：紅外光譜定性分析表明,嬰幼兒結(jié)石由尿酸和三聚氰胺組成,并且我們認(rèn)為是以三聚氰胺-尿酸復(fù)合大分子形式存在。第二節(jié) 三聚氰胺結(jié)石的液相色譜定量分析目的：建立高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)結(jié)石或尿液中中三聚氰胺、三聚氰胺及尿酸的方法,并測(cè)定三聚氰胺引發(fā)的嬰幼兒泌尿系結(jié)石的成分。方法：采用Agilent 1100型高效液相色譜儀、Agilent HC-C 18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)、Agilent Zorbax Entend-C18 (4.6×12.5 mm,5μm)保護(hù)柱、10mmol/l磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)流動(dòng)相、200 nm檢測(cè)波長(zhǎng)及1.0 ml/min流速同時(shí)檢測(cè)溶液中三聚氰胺、三聚氰酸及尿酸濃度。1例三聚氰胺引發(fā)的兒童泌尿系結(jié)石經(jīng)預(yù)處理后,采用該法檢測(cè)其成分。結(jié)果：三聚氰胺最低檢測(cè)限為0.005 μg/ml,線性范圍為0.05-50 μg/ml,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差10%,平均回收率90%。三聚氰胺最低檢測(cè)限為0.025 μg/ml,線性范圍為0.1-50,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差10%,平均回收率90%。尿酸最低檢測(cè)限為0.025 μg/ml,線性范圍為0.1-50 μg/ml,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差10%,平均回收率90%。1例三聚氰胺結(jié)石主要含有尿酸和三聚氰胺成分,二者摩爾比為2.1：1,且占結(jié)石重量的89.6%。結(jié)論：高效液相色譜法可同時(shí)檢測(cè)尿液中或結(jié)石中三聚氰胺、三聚氰胺及尿酸。該法方便、快捷及準(zhǔn)確。三聚氰胺引發(fā)的兒童尿路結(jié)石的主要成分為尿酸和三聚氰胺成分,二者摩爾比為1：2.1。第三章 三聚氰胺對(duì)泌尿系細(xì)胞株損傷的研究目的：探討三聚氰胺對(duì)腎臟近端小管上皮細(xì)胞、腎臟遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞、及膀胱上皮細(xì)胞的損傷毒性和預(yù)防損傷的措施。方法：CCK-8法檢測(cè)0、625、1250、2500及5000 μg/ml三聚氰胺干預(yù)人腎臟近端小管上皮細(xì)胞(HK-2)、犬腎臟遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞(MDCK)及人膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1) 24 h后的細(xì)胞增殖率。TBA法、DCFH-DA法及Annexin V-FITC/PI法分別檢測(cè)0、625、1250、2500及5000 μg/ml三聚氰胺干預(yù)HK-2、MDCK及SV-HUC-1細(xì)胞12h后,培養(yǎng)液丙二醛(MDA)水平、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平及細(xì)胞凋亡率。一定濃度的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及甘露醇與2500 μg/ml三聚氰胺聯(lián)合干預(yù)HK-2、MDCK及SV-HUC-1細(xì)胞24 h, CCK-8法檢測(cè)檢測(cè)相應(yīng)的細(xì)胞增殖率。結(jié)果：三聚氰胺干預(yù)HK-2、MDCK及SV-HUC-1細(xì)胞24 h的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為3817、3118和4101 μg/ml。2500及5000 μg/ml三聚氰胺干預(yù)HK-2、MDCK及SV-HUC-1細(xì)胞12h后,三種細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA水平明顯高于陰性對(duì)照組(P0.05),三種細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平明顯高于陰性對(duì)照組(P0.05),三種細(xì)胞的凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組(P0.05)。對(duì)比2500 μg/ml三聚氰胺干預(yù)HK-2、MDCK及SV-HUC-1細(xì)胞的24 h增殖率,聯(lián)合CAT及甘露醇干預(yù)后三種細(xì)胞的24 h增殖率明顯升高(P0.05),但聯(lián)合SOD干預(yù)后三種細(xì)胞的24 h增殖率無明顯變化。結(jié)論：三聚氰胺本身對(duì)腎臟近端、遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞及膀胱上皮細(xì)胞的毒性較低,但高劑量三聚氰胺也可導(dǎo)致明顯的細(xì)胞損傷,該種細(xì)胞毒性涉及氧化應(yīng)激和凋亡機(jī)制�？寡趸瘎┻^氧化氫酶和甘露醇可對(duì)三聚氰胺所致的腎臟近端、遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞及膀胱上皮細(xì)胞的增殖毒性有保護(hù)作用。第四部分：三聚氰胺所致嬰幼兒泌尿系毒性效應(yīng)機(jī)制的探討目的：探討三聚氰胺毒奶粉引發(fā)嬰幼兒泌尿系結(jié)石及腎損傷發(fā)生機(jī)制。方法：0.3%、1%及3%三聚氰胺飼料分別喂食雄性SD大鼠4周,探討三聚氰胺對(duì)尿液中結(jié)石形成相關(guān)因素、泌尿系結(jié)石的發(fā)生及腎損傷的影響。采用氧嗪酸鉀與尿酸注射大鼠腹腔制造高尿液尿酸大鼠模型,1%三聚氰胺飼料喂食該模型大鼠4周,探討尿液尿酸對(duì)三聚氰胺引發(fā)泌尿系結(jié)石與腎損傷的影響。1%三聚氰胺聯(lián)合半量蛋白含量的飼料喂食大鼠4周,探討低蛋白飲食對(duì)三聚氰胺引發(fā)泌尿系結(jié)石與腎損傷的影響。1%三聚氰胺聯(lián)合0.01%三聚氰酸飼料喂食大鼠4周,探討三聚氰胺摻雜微量三聚氰酸對(duì)三聚氰胺引發(fā)泌尿系結(jié)石與腎損傷的影響。正常飼料喂食大鼠4周為陰性對(duì)照。所有大鼠處死前收集24 h尿液,檢測(cè)尿液中與結(jié)石形成的相關(guān)因素。處死后,留取血液檢測(cè)血電解質(zhì)與生化相關(guān)指標(biāo),分析結(jié)石成分,及肉眼和顯微鏡下觀察腎臟組織的損傷情況。結(jié)果：3%三聚氰胺飼料喂食大鼠后,相比正常飼料喂食組,24 h尿液量及鈣濃度明顯升高,草酸及枸櫞酸濃度明顯下降,pH、尿酸及磷酸離子濃度則無明顯改變,腎臟功能與組織損傷明顯加重。1%三聚氰胺喂食高尿液尿酸模型大鼠后,腎臟實(shí)質(zhì)內(nèi)見晶體沉著,腎臟功能及組織損傷程度明顯重于1%三聚氰胺喂食大鼠。1%三聚氰胺聯(lián)合半量蛋白飼料喂食大鼠后,腎臟組織損傷程度較1%三聚氰胺飼料喂食大鼠略重。1%三聚氰胺與0.01%三聚氰酸聯(lián)合喂食大鼠后,腎臟實(shí)質(zhì)內(nèi)見晶體沉著,腎臟功能及組織損傷程度明顯重于1%三聚氰胺喂食大鼠的相應(yīng)指標(biāo)。0.3%、1%、3%三聚氰胺飼料喂食大鼠、1%三聚氰胺飼料喂食尿液高尿酸模型大鼠、1%三聚氰胺聯(lián)合半量蛋白飼料喂食大鼠、及1%三聚氰胺與0.01%三聚氰酸飼料聯(lián)合喂食大鼠的結(jié)石發(fā)生率分別0、20%、50%、30%、10%及20%,第2-5組大鼠結(jié)石成分為三聚氰胺和微量尿酸,第6組結(jié)石成分為三聚氰胺為三聚氰胺,微量三聚氰酸,及微量尿酸。結(jié)論：高劑量三聚氰胺飼料喂食雄性SD大鼠1月,可引發(fā)泌尿系結(jié)石及腎損傷,并且尿液中部分結(jié)石形成相關(guān)因子的濃度明顯變化。在尿液高尿酸濃度的條件下,三聚氰胺對(duì)腎臟毒性明顯增強(qiáng),腎臟組織內(nèi)可有晶體鹽沉積,但結(jié)石的發(fā)生率無明顯變化。在半量蛋白飲食的條件下,三聚氰胺對(duì)腎臟毒性輕微加重,但結(jié)石的發(fā)生率無明顯變化。在三聚氰胺含有較高三聚氰酸雜質(zhì)的條件下,三聚氰胺對(duì)腎臟毒性明顯增強(qiáng),腎臟組織內(nèi)可有晶體鹽沉積。第五部分：三聚氰胺潛在性腎損傷和膀胱癌的研究及防治探討目的:研究大鼠三聚氰胺長(zhǎng)期暴露后腎臟和膀胱的損傷狀況,并探討相應(yīng)的預(yù)防措施。方法：將130只斷奶后雄性F344大鼠隨機(jī)分為5組,分別為正常飼料組(A)、3%三聚氰胺(前24周)+正常飼料(后24周)(B)、3%三聚氰胺組(C)、3%三聚氰胺+3%茶葉組(D)、及3%三聚氰胺+0.02%染料木素組(E),每組分別為20、20、30、30、及30只,實(shí)驗(yàn)周期為48周。第24周,除B組外,每組處死10只大鼠。第48周處死剩余全部大鼠。處死后,留取大鼠血液作腎臟功能指標(biāo)檢測(cè),稱取大鼠泌尿系結(jié)石、腎臟、及膀胱重量,肉眼觀察腎臟及膀胱組織形態(tài),病理組織學(xué)觀察腎臟組織的損傷情況和膀胱上皮腫瘤形成情況,FTIR和HPLC法分析結(jié)石成分。結(jié)果：第24周,C、D、E組中大鼠的平均血肌酐濃度均大于陰性對(duì)照組A(P0.05),D組中大鼠的平均血肌酐濃度小于陽性對(duì)照組C (P 0.05)。C、D、E組中部分大鼠腎臟實(shí)質(zhì)內(nèi)可見遠(yuǎn)端小管擴(kuò)張,管腔內(nèi)見晶體沉著,間質(zhì)組織纖維化和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。C、D、E組中大鼠尿路結(jié)石發(fā)現(xiàn)率為100%,90%,及100%,每組每只大鼠的平均結(jié)石重量0.1 g,結(jié)石成分均為三聚氰胺及微量尿酸。膀胱重量系數(shù)(膀胱重量／體重)均大于陰性對(duì)照組A (P0.05), C、D、E組中大鼠的膀胱腔內(nèi)未見明顯腫塊,膀胱上皮細(xì)胞均明顯增生(100%)。第48周,B、C、D、E組中大鼠的平均血肌酐濃度及及腎臟重量系數(shù)(雙腎重量/體重×1000)均大于陰性對(duì)照組A(P0.05,B組的平均血肌酐濃度除外),D組中大鼠的平均血肌酐濃度小于大于陽性對(duì)照組C (P0.05), B、C、D, E組中部分大鼠腎臟實(shí)質(zhì)內(nèi)中可見遠(yuǎn)端管擴(kuò)張,間質(zhì)組織纖維化和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),腎小球硬化,且間質(zhì)組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化程度較第24周加重。B、C、D、E組中大鼠結(jié)石的發(fā)現(xiàn)率分別5%、44.4%、33.3%及52.6%,每組每只大鼠的平均結(jié)石重量0.01 g,膀胱重量系數(shù)(膀胱重量/體重)均大于陰性對(duì)照組A (P0.05), B、C、D、E組中膀胱癌的發(fā)現(xiàn)率為22.2%、72.3%、22.2%、及31.6%,B、D、及E組中大鼠膀胱腫塊及膀胱癌的發(fā)現(xiàn)率均小于C組(P0.05)。結(jié)論：高劑量三聚氰胺喂食斷奶后雄性F344大鼠1年內(nèi)可導(dǎo)致泌尿系結(jié)石、大鼠的腎臟功能及組織均受損、及膀胱上皮細(xì)胞癌變,其中后半年比較前半年,尿路結(jié)石自發(fā)減少或消失,大鼠的腎臟功能及組織受損加重,且增生膀胱上皮細(xì)胞發(fā)生癌變。高劑量三聚氰胺喂食大鼠半年后正常飲食半年,大鼠的腎臟功能和組織仍受損,增生膀胱上皮細(xì)胞發(fā)生癌變,但腎臟功能受損程度明顯減輕及膀胱癌的發(fā)生率明顯降低。高劑量茶葉喂食大鼠可減輕高劑量三聚氰胺所致腎臟功能受損程度,高劑量茶葉或微量染料木素喂食大鼠可明顯降低高劑量三聚氰胺所致膀胱癌的發(fā)生率。第六章：頭孢曲松泌尿系結(jié)石的理化分析及風(fēng)險(xiǎn)因素的體外研究第一節(jié) 頭孢曲松泌尿系結(jié)石的理化分析(附病案報(bào)道)目的：探討頭孢曲松鈉引發(fā)尿路結(jié)石的理化性質(zhì)。方法：2012年4月我院收到2例頭孢曲松鈉引發(fā)的兒童尿路結(jié)石,其中1例為省外醫(yī)院送檢樣本,患兒臨床資料缺。另一例患兒4月初頭孢曲松鈉治療5天后突發(fā)下腹痛、嘔吐。B超檢查：右輸尿管結(jié)石。KUB檢查：未見結(jié)石影,CT檢查：右輸尿管上段結(jié)石伴積水,保守治療3天后結(jié)石排出,B超和IVP復(fù)查：未見結(jié)石影。采用紅外光譜、掃描電子顯微鏡及能譜儀分析2例尿路結(jié)石的成分。結(jié)果：2例頭孢曲松鈉引發(fā)的兒童尿路結(jié)石樣本均由頭孢曲松和鈣離子構(gòu)成,且摩爾比為1：1。結(jié)論：頭孢曲松鈉可引發(fā)尿石癥,該結(jié)石具有X線下不顯影的影像學(xué)特征,尿路結(jié)石成分為頭孢曲松鈣鹽。第二節(jié) 頭孢曲松泌尿系結(jié)石形成風(fēng)險(xiǎn)的體外研究目的：初步探討頭孢曲松泌尿系結(jié)石形成風(fēng)險(xiǎn)。方法：根據(jù)兒童頭孢曲松泌尿系結(jié)石的成分,尿液在膀胱內(nèi)過夜時(shí)間,尿液中頭孢曲松離子、鈣離子、枸櫞酸離子濃度,尿pH值范圍,及尿液離子積大小設(shè)定相關(guān)參數(shù),調(diào)查結(jié)晶時(shí)間、頭孢曲松離子濃度、鈣離子濃度、枸櫞酸離子濃度、及pH對(duì)頭孢曲松離子和鈣離子在離子積為0.16 M的水溶液中晶體化的影響。溶液中減少的鈣離子/總鈣離子×100%作為頭孢曲松鈣晶體化程度的指標(biāo)。結(jié)果：頭孢曲松鈣晶體化程度與結(jié)晶時(shí)間、頭孢曲松離子濃度、鈣離子濃度、枸櫞酸離子濃度、及pH具有相關(guān)性,其中結(jié)晶時(shí)間、頭孢曲松離子濃度、鈣離子濃度的大小與頭孢曲松鈣晶體化程度具有正相關(guān)性,而枸櫞酸離子濃度及pH的大小與頭孢曲松鈣晶體程度具有副負(fù)相關(guān)性。結(jié)論：頭孢曲松鈉治療劑量過高、尿路梗阻、尿液成石因子異�？赡艽龠M(jìn)頭孢曲松鈉引發(fā)泌尿系結(jié)石的形成。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R726.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 任保增,李晨,袁曉亮,王福安;三聚氰胺溶解度的測(cè)定與關(guān)聯(lián)[J];化工學(xué)報(bào);2003年07期

本文編號(hào)：2776129