發(fā)布時間：2020-07-30 12:27

【摘要】：目的研究micro RNA-145(miR-145)對轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法人工合成miR-145基因序列,構(gòu)建真核重組質(zhì)粒p CMVmiR-145。以未處理HK-2細(xì)胞為對照組;以TGF-β1處理HK-2細(xì)胞為TGF-β1組;以p CMV-myc空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后經(jīng)TGF-β1處理HK-2細(xì)胞為TGF-β1空白質(zhì)粒組;以p CMV-miR-145質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后經(jīng)TGF-β1處理HK-2細(xì)胞為TGF-β1+miR-145組。采用實時熒光定量PCR檢測miR-145表達(dá)。采用Western blot檢測TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)蛋白TGF-β1、Smad3、Smad2/3、p-Smad2/3,以及EMT生物標(biāo)記物蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)和I型膠原蛋白(ColⅠ)的表達(dá)水平。采用ELISA法檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液中FN和Col I的含量。結(jié)果miR-145表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,重組質(zhì)粒有效轉(zhuǎn)染TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞。與對照組比較,TGF-β1+miR-145組細(xì)胞中miR-145表達(dá)上調(diào)(P0.01);與對照組和TGF-β1+miR-145組比較,TGF-β1組和TGF-β1空白質(zhì)粒組細(xì)胞中miR-145表達(dá)均下降(P0.01)。與TGF-β1組和TGF-β1空白質(zhì)粒組比較,TGF-β1+miR-145組細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、Smad3、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表達(dá)量減少(P0.05);α-SMA、FN、ColⅠ蛋白表達(dá)亦明顯減少(P0.05);TGF-β1+miR-145組培養(yǎng)液上清中FN、ColⅠ含量減少(P0.05)。結(jié)論 miR-145參與TGF-β1處理HK-2細(xì)胞EMT的調(diào)控。miR-145可能通過抑制TGF-β依賴的Smad信號通路活性,從而抑制腎小管EMT。
【圖文】：

驗獨立重復(fù)3次。1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1不同分組細(xì)胞形態(tài)特點光鏡（nikoneclipseE400，日本）下顯示，對照組細(xì)胞間連接緊密，呈鵝卵石樣生長。TGF-β1組中細(xì)胞間隙明顯增加，部分細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離，形態(tài)由鵝卵石形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮�。TGF-β1+miR-145組細(xì)胞大部分恢復(fù)為鵝卵石樣，但仍有少部分為梭形，細(xì)胞脫離黏附的現(xiàn)象也有所減少。見圖1。對照組TGF-β1組TGF-β1空白質(zhì)粒組TGF-β1+miR-145組圖1各組細(xì)胞光鏡下形態(tài)學(xué)改變（×200）對照組細(xì)胞連接緊密，呈鵝卵石樣；TGF-β1組細(xì)胞間隙明顯增加，部分細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離，呈梭形；TGF-β1空白質(zhì)粒組細(xì)胞呈梭型，間隙增加；TGF-β1+miR-145組細(xì)胞多數(shù)形態(tài)呈鵝卵石樣，細(xì)胞脫離黏附較少。

泳結(jié)果顯示1、2、4~10號克隆在250bp與500bp之間有明亮特異的擴增條帶（圖2）。接種1號陽性轉(zhuǎn)化子，分裝200μL送檢測序。采用DNAStar的MegAlign軟件對插入片段進(jìn)行測序，結(jié)果證實插入片段與設(shè)計序列完全匹配。2.3熒光倒置顯微鏡檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞狀態(tài)經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后，在熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯IX81，日本）視野下可觀察到空白質(zhì)粒組對照組空白質(zhì)粒組miR-145組圖3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞的檢測（熒光倒置顯微鏡，×80）對照組無HK-2細(xì)胞發(fā)出熒光信號；空白質(zhì)粒組和miR-145組均可見大量HK-2細(xì)胞發(fā)出綠色熒光信號。圖2GR325瓊脂糖凝膠電泳圖M：Marker；N：陰性對照；1、2、4~10為陽性轉(zhuǎn)化子；3為陰性轉(zhuǎn)化子。500bp400bp250bp12345678910MN2.4miR-145表達(dá)檢測實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，各組細(xì)胞內(nèi)miR-145表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=157.103，P<0.001）。與對照組（0.526±0.024）和空白質(zhì)粒組（0.537±0.016）比較，miR-145組細(xì)胞內(nèi)miR-145表達(dá)（0.836±0.052）顯著升高（P<0.01）；而對照組與空白質(zhì)粒組比較，miR-145水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。2.5TGF-β1刺激對HK-2細(xì)胞miR-145表達(dá)的影響實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，予5μg/LTGF-β1刺激24h后，各組細(xì)胞內(nèi)miR-145表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=180.225，P<0.001）。與對照組（0.526±0.024）和TGF-β1+miR-145組（0.733±0.064）比較，TGF-β1組（0.312±0.014）和TGF-β1空白質(zhì)粒組（0.331±0.018）miR-145表達(dá)明顯下降（P<0.01）。與對照組比較，TGF-β1+miR-145組miR-145表達(dá)升高（P<0.01）。TGF-β1組和TGF-β1空白質(zhì)粒組比較，miR-145水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。2.6miR-145對HK-2細(xì)胞TGF-β/Smad信號蛋白的影響Westernblot印跡結(jié)果顯示，予

淼?期2017年6月中國當(dāng)代兒科雜志ChinJContempPediatrVol.19No.6Jun.2017·715·2.2miR-145表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建miR-145基因擴增片段凝膠電泳結(jié)果顯示1、2、4~10號克隆在250bp與500bp之間有明亮特異的擴增條帶（圖2）。接種1號陽性轉(zhuǎn)化子，分裝200μL送檢測序。采用DNAStar的MegAlign軟件對插入片段進(jìn)行測序，結(jié)果證實插入片段與設(shè)計序列完全匹配。2.3熒光倒置顯微鏡檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞狀態(tài)經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后，在熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯IX81，日本）視野下可觀察到空白質(zhì)粒組對照組空白質(zhì)粒組miR-145組圖3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞的檢測（熒光倒置顯微鏡，×80）對照組無HK-2細(xì)胞發(fā)出熒光信號；空白質(zhì)粒組和miR-145組均可見大量HK-2細(xì)胞發(fā)出綠色熒光信號。圖2GR325瓊脂糖凝膠電泳圖M：Marker；N：陰性對照；1、2、4~10為陽性轉(zhuǎn)化子；3為陰性轉(zhuǎn)化子。500bp400bp250bp12345678910MN2.4miR-145表達(dá)檢測實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，各組細(xì)胞內(nèi)miR-145表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=157.103，P<0.001）。與對照組（0.526±0.024）和空白質(zhì)粒組（0.537±0.016）比較，miR-145組細(xì)胞內(nèi)miR-145表達(dá)（0.836±0.052）顯著升高（P<0.01）；而對照組與空白質(zhì)粒組比較，miR-145水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。2.5TGF-β1刺激對HK-2細(xì)胞miR-145表達(dá)的影響實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，予5μg/LTGF-β1刺激24h后，各組細(xì)胞內(nèi)miR-145表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=180.225，P<0.001）。與對照組（0.526±0.024）和TGF-β1+miR-145組（0.733±0.064）比較，TGF-β1組（0.312±0.014）和TGF-β1空白質(zhì)粒組（0.331±0.018）miR-145表達(dá)明顯下降（P<0.01）。與對照組比較，TGF-β1+miR-145組miR-145表達(dá)升高（P<0.01）。TGF-β1組和TG

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本文編號：2775540