【摘要】：腎臟纖維化(Renal Fibrosis,RF)是所有慢性腎臟病(chronic kidney diseases,CKD)發(fā)展至終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的共同途徑。RF機(jī)制尚未完全清楚,可能與炎癥反應(yīng)、腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Eβithelial Mesenchymal Transition,EMT)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)過度沉積有關(guān)。EMT主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性喪失、獲得表達(dá)α-SMA的表型、腎小管基底膜(tubular basement membrane,TBM)結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞遷徙和浸潤性增強,而且還可以分泌多種細(xì)胞因子曾參與炎癥反應(yīng)和纖維化過程。在眾多致纖維化因子中,TGF-β是最主要的啟動EMT的發(fā)生發(fā)展的生長因子,可以通過激活Smad信號通路調(diào)控ECM相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。MAPK(P38/ERK/JNK)信號通路可通過促TGF-β1產(chǎn)生和活化、調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號通路、不依賴于TGF-β1途徑產(chǎn)生促纖維效應(yīng)。異黏蛋白(Metadherin,Mtdh)是位于8q22染色體上的原癌基因,目前認(rèn)為它能夠和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin、NF-KB、MAPK等多個信號通路相互作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲過程。Mtdh/SND1可被TGF-β激活促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移;Mtdh通過促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬,增加惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TGF-β誘導(dǎo)EMT的敏感性,提示Mtdh可能與多種信號通路存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。然而Mtdh在腎臟疾病,尤其是腎臟纖維化中的作用尚未明確。本實驗通過建立纖維化模型來揭示Mtdh在腎臟纖維化中的作用及可能機(jī)制。(一)Mtdh在腎臟纖維化模型的腎組織表達(dá)1.1Mtdh在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型腎臟中的表達(dá)目的:探討Mtdh在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠模型腎臟中的表達(dá)。方法:建立單側(cè)輸尿管梗阻模型:SPF級C57小鼠12只(購于南方醫(yī)科大學(xué)動物中心),將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)和單側(cè)輸尿管梗阻組(UUO),每組6只小鼠。UUO組行左側(cè)輸尿管梗阻手術(shù),sham組小鼠左側(cè)輸尿管僅游離不結(jié)扎。14天后處死小鼠,灌流沖洗后留取左側(cè)腎臟組織標(biāo)本。采用HE染色和Masson染色觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)和纖維膠原沉積程度;采用免疫組織化學(xué)法檢測腎組織纖維化相關(guān)蛋白Fibronectin、E.cadherin、α-SMA的表達(dá)及Mtdh的表達(dá);采用 Westen blot 法檢測 Fibronectin、E.cadherin、α-SMA 和 Mtdh 的表達(dá)。結(jié)果:Mtdh免疫組化結(jié)果顯示,Mtdh主要表達(dá)于腎小管和腎小球中,UUO組Mtdh表達(dá)增加;Western blot結(jié)果顯示UUO組Mtdh蛋白表達(dá)增加(P0.05);免疫組化和Western blot結(jié)果顯示UUO組纖維化指標(biāo)Fibronectin、α-SMA表達(dá)增加,上皮細(xì)胞標(biāo)記物E.cadherin則表達(dá)下調(diào)(P0.05)。1.2Mtdh在糖尿病腎病模型腎組織中的表達(dá)目的:探究 Mtdh在糖尿病腎病纖維化模型中的表達(dá)方法:構(gòu)建糖尿病腎病動物模型:20只Leptin受體基因缺陷背景的先天肥胖性2型DM小鼠(db/db)和10只同周齡同窩野生型小鼠(db/rn)對照組(購于南京大學(xué)模式動物研究所),分為DN組(db/db小鼠)和正常對照組(db/m小鼠)。飼養(yǎng)至小鼠21周時終止實驗,收集血清檢測FBG、Scr、BUN;收集腎臟組織,經(jīng)多聚甲醛固定后制作石蠟切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色檢測Mtdh及纖維化指標(biāo)Fibronectin、E.cadherin、α-SMA 的表達(dá)。結(jié)果:db/db小鼠的FBG與db/m組相比顯著升高(p0.001);db/db小鼠Scr水平明顯高于db/m小鼠(p0.001);BUN在db/db小鼠與db/m小鼠之間未有明顯差異(p0.05);血脂指標(biāo),包括總膽固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride,TG),db/db小鼠均明顯高于db/m小鼠(p0.05)。免疫組化結(jié)果顯示db/db小鼠的Fibronectin、α-SMA的表達(dá)增加,而E.cadherin表達(dá)減少,表明db/db小鼠已出現(xiàn)糖尿病腎病纖維化病變。Mtdh表達(dá)在db/db小鼠中明顯增多,以腎間質(zhì)增多更顯著。小結(jié):Mtdh在UUO梗阻腎病纖維化和糖尿病腎病纖維化模型腎組織中表達(dá)升高,可能在促進(jìn)糖尿病腎病纖維化過程中起作用。(二)Mtdh在腎小管上皮細(xì)胞EMT中的作用及可能機(jī)制目的:探討Mtdh在TGF-β1誘導(dǎo)EMT模型中的作用及其可能機(jī)制。方法:以5ng/m1TGF-β1刺激腎小管上皮細(xì)胞(mTEC細(xì)胞),設(shè)置0、12、24、48h時間點,誘導(dǎo)EMT模型。采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建Mtdh穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株(LV-Mtdh),采用Western blot法檢測Mtdh過表達(dá)效率和EMT表型蛋白Fibronectin、E.cadherin、α-SMA及ERK/P38信號通路分子的表達(dá);采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建Mtdh穩(wěn)定下調(diào)表達(dá)細(xì)胞株(sh-Mtdh),加TGF-β1刺激后,采用Western blot法檢測Mtdh下調(diào)效率和EMT表型蛋白Fibronectin、E.cadherin、α-SMA及ERK/P38信號通路分子的表達(dá)。結(jié)果:TGF-β1 刺激 mTEC 細(xì)胞,使 Fibronectin、α-SMA 表達(dá)增加,E.cadherin則表達(dá)下調(diào),隨刺激時間增加而愈加明顯,表明TGF-β誘導(dǎo)EMT模型構(gòu)建成功。Mtdh的表達(dá)隨著TGF-β1刺激時間增加而上調(diào)(P0.05)。構(gòu)建Mtdh穩(wěn)定過表達(dá)mTEC細(xì)胞株LV-Mtdh,Mtdh蛋白表達(dá)比LV-NC組明顯增多,表明穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。LV-Mtdh組比LV-NC組的Fibronectin、α-SMA、COLI表達(dá)增加,E.cadherin則表達(dá)下調(diào)(P0.05);LV-Mtdh組ERK和P38磷酸化水平比LV-NC組增加(P0.05)。構(gòu)建Mtdh穩(wěn)定下調(diào)mTEC細(xì)胞株sh-Mtdh,Mtdh蛋白表達(dá)比sh-NC組明顯減少,表明穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系構(gòu)建成功。sh-Mtdh組受TGF-β1 誘導(dǎo)后 Fibronectin、α-SMA 比 sh-NC 對照組表達(dá)下降(P0.05),E.cadherin則比sh-NC對照組表達(dá)升高(P0.05);sh-Mtdh組受TGF-β1誘導(dǎo)后ERK和P38磷酸化水平比sh-NC組降低(P0.05)。小結(jié):Mtdh在TGF-β誘導(dǎo)EMT模型中表達(dá)上調(diào),過表達(dá)Mtdh可促進(jìn)ECM蛋白Fibronectin、α-SMA表達(dá),抑制上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E.cadherin表達(dá),增加P38/ERK磷酸化水平,抑制Mtdh后mTEC對TGF-β1誘導(dǎo)EMT模型敏感性下降,Mtdh可能通過調(diào)節(jié)P38/ERK信號通路促進(jìn)EMT過程。結(jié)論:Mtdh在細(xì)胞EMT模型和UUO模型及db/db模型中均表達(dá)增加;Mtdh促進(jìn)Fibronectin、α-SMA的表達(dá),減少E.cadherin的表達(dá),促進(jìn)EMT過程;同時提高ERK/P38磷酸化水平,激活ERK/P38信號通路,加重腎臟纖維化病變。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692
【圖文】：

為進(jìn)一步確定ＵＵＯ小鼠腎臟纖維化模型是否成功，我們使用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑方法和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測ＥＭＴ標(biāo)記物Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａ－ＳＭＡ、Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ逡逑的表達(dá)情況。如圖１－２所示，腎臟組織Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａ－ＳＭＡ主要表達(dá)于腎臟間質(zhì)逡逑基質(zhì)，Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞上；ＵＵＯ組Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａ－ＳＭＡ逡逑染色陽性面積明顯高于ｓｈａｍ組，而Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ則呈現(xiàn)相反趨勢。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ法逡逑檢測ＵＵＯ組腎臟組織（圖１－３Ａ），Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａ－ＳＭＡ的蛋白水平高于ｓｈａｍ組逡逑（Ｐ＜０．０５），Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ則顯著低于ｓｈａｍ組（Ｐ＜０．０１），與免疫組織化學(xué)染色結(jié)逡逑果一致。逡逑在腎臟纖維化模型成立的條件下，為了檢測Ｍｔｄｈ在ＵＵＯ小鼠腎臟中的表逡逑達(dá)及定位，本實驗使用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)進(jìn)行檢測。如逡逑圖１－４Ａ所示，ＵＵＯ組腎臟組織Ｍｔｄｈ的蛋白水平明顯高于ｓｈａｍ組（圖１－４Ｂ，逡逑Ｐ＜０．０５）。從免疫組織化學(xué)染色片子來看

圖１－３．Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＵＵＯ模型小鼠腎臟組織纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)逡逑－

２．３ｄｂ／ｄｂ小鼠腎臟組織病理符合ＤＫＤ疾病改變逡逑為觀察ＤＫＤ病變，使用ＰＡＳＭ染色觀察腎臟組織的系膜基質(zhì)、ＧＢＭ和ＴＢＭ。逡逑如圖１－５所示，從腎臟組織ＰＡＳＭ染色中可看出，ｄｂ／ｄｂ組小鼠腎小球系膜增生逡逑明顯，系膜區(qū)增寬，部分腎小球硬化。ｄｂ／ｄｂ組符合ＤＫＤ病理改變，腎小球損逡逑傷明顯重于ｄｂ／ｍ組。逡逑ｄｂ／ｍ邐ｄｂ／ｄｂ逡逑圖１－５．邋ｄｂ／ｄｂ小鼠ＰＡＳＭ染色圖（２００Ｘ，紅色箭頭為系膜區(qū)增生）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５．邋ＰＡＳＭ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｄｂ／ｄｂ邋ａｎｄ邋ｄｂ／ｍ邋ｍｉｃｅ（２００－ｆｏｌｄ）逡逑（Ｒｅｄ邋ａｒｒｏｗ邋ｓｈｏｗｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅｓａｎｇｉａｌ邋ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ邋ａｒｅａ）逡逑２５逡逑

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