【摘要】：目的:足細(xì)胞凋亡是糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)足細(xì)胞損傷的早期中心環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞浸潤是糖尿病腎病的重要特征,在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而,巨噬細(xì)胞對DN足細(xì)胞凋亡的作用目前尚不清楚。本研究通過構(gòu)建STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型及體外巨噬細(xì)胞和足細(xì)胞共培養(yǎng)兩方面,觀察糖尿病腎病狀態(tài)下活化的巨噬細(xì)胞對足細(xì)胞凋亡的作用,并探討其內(nèi)在的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn):將SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、糖尿病腎病(DN)組。利用鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)一次性腹腔注射建立DN模型,建模后18w末處死動(dòng)物,留取血、尿、腎組織標(biāo)本,檢測血糖、血肌酐(serum creatinine,Scr)、24小時(shí)尿蛋白變化,脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling,Tunel)檢測腎組織足細(xì)胞凋亡,免疫組化法檢測腎組織CD68~+巨噬細(xì)胞浸潤,8-羥化脫氧鳥苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)染色檢測腎組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)水平,Western blot檢測腎組織p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)和磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38MAPK)蛋白表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):1.Transwell共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞(Raw264.7)與足細(xì)胞(MPC),取Raw264.7巨噬細(xì)胞以2×10~5,4×10~5,8×10~5/孔濃度接種于6孔板Transwell的上室濾膜上培養(yǎng)并同步化,同時(shí)取MPC足細(xì)胞以4×10~5/孔濃度接種于6孔板培養(yǎng)并同步化,隨后將上述含有Raw264.7巨噬細(xì)胞的上室放入含有MPC足細(xì)胞的六孔板中培養(yǎng),在此共培養(yǎng)體系中加或不加25 mM高葡萄糖(High glucose,HG)或者25mM甘露醇(Mannitol,Man)培養(yǎng)48h。2.首先體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,將其分為三組:正常葡萄糖組(NC)、甘露糖組(Man)、高葡萄糖組(HG),24h后PBS清洗后予以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后收集上述NC組巨噬細(xì)胞上清液(NC-CM)和HG組巨噬細(xì)胞上清液(HG-CM)。采用Western blot和免疫熒光染色檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(inducible Nitric oxide synthase,iNOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis facto-α,TNF-α)和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(Mannose receptor,MR)表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)檢測巨噬細(xì)胞上清液TNF-α水平。其次,體外培養(yǎng)小鼠永生系足細(xì)胞MPC5,將其分為以下幾組:正常葡萄糖對照組(NC),NC-CM組,HG-CM組,HG-CM+ROS抑制劑組(HG-CM+Tempo),HG-CM+p38MAPK抑制劑組(HG-CM+SB203580),HG-CM+抗TNF-α中和抗體組(HG-CM+TNF-αneutralizing antibody),HG-CM+中和抗體對照劑IgG組(HG-CM+IgG),重組小鼠TNF-α組。采用Annexin V-FITC/PI和Hoechst33342染色檢測足細(xì)胞凋亡率,2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2',7'-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)染色檢測足細(xì)胞ROS水平,Western blot檢測足細(xì)胞cleaved casepase-3、p38MAPK和p-p38MAPK表達(dá)。結(jié)果:1.與正常對照組相比,DN組大鼠血糖水平明顯增加,體重下降,Scr水平和24小時(shí)尿蛋白明顯增加。與對照組相比,DN組大鼠腎組織足細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加,腎組織CD68~+巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯增加。為進(jìn)一步探討糖尿病腎病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞對足細(xì)胞凋亡的作用,建立體外巨噬細(xì)胞和足細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,高糖能增加足細(xì)胞凋亡,促進(jìn)足細(xì)胞凋亡蛋白cleaved casepase-3蛋白表達(dá)。在高糖條件下的Transwell共培養(yǎng)體系中,巨噬細(xì)胞能顯著增加高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步上調(diào)足細(xì)胞cleaved casepase-3蛋白表達(dá),呈細(xì)胞數(shù)量依賴性。但是,在正常濃度葡萄糖條件下的Transwell共培養(yǎng)體系中,足細(xì)胞未發(fā)生凋亡反應(yīng)。這提示巨噬細(xì)胞可能在高糖壞境下發(fā)生活化后加重足細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞在高糖刺激后呈促炎性M1型活化,高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物iNOS,而M2型細(xì)胞標(biāo)志物MR表達(dá)明顯減少。收集正常葡萄糖培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞上清液NC-CM和高糖培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞上清液HG-CM并以此干預(yù)足細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常對照組與NC-CM組兩組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)足細(xì)胞凋亡水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組和NC-CM組相比,HG-CM組足細(xì)胞凋亡明顯增加,呈時(shí)間依賴性。2.與正常對照組相比,DN大鼠腎小球ROS水平增加,腎組織p38MAPK活化水平即p-p38MAPK蛋白表達(dá)增多,p-p38MAPK/p38 MAPK比值明顯上調(diào)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常對照組(NC)和NC-CM組相比,HG-CM組足細(xì)胞ROS水平明顯增加,足細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)增多,p-p38MAPK/p38MAPK比值上調(diào)。ROS阻斷劑Tempo能阻斷HG-CM誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡,減輕足細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá),同時(shí)抑制足細(xì)胞p-p38MAPK活化,降低p-p38MAPK蛋白表達(dá)和p-p38MAPK/p38MAPK比值。p38 MAPK蛋白活化抑制劑SB203580能顯著降低HG-CM誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡,抑制足細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)。3.與巨噬細(xì)胞NC-CM上清液相比,巨噬細(xì)胞HG-CM上清液中TNF-α顯著升高。Western印跡結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞予以高糖刺激后,TNF-α蛋白表達(dá)明顯增加。與HG-CM組相比,抗TNF-α中和抗體能顯著減少HG-CM誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡,降低cleaved caspase 3蛋白表達(dá),同時(shí)下調(diào)HG-CM誘導(dǎo)的足細(xì)胞ROS產(chǎn)生,降低足細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)和p-p38MAPK/p38 MAPK比值。足細(xì)胞予以重組小鼠TNF-α單獨(dú)刺激后,其凋亡數(shù)量明顯增加,cleaved caspase 3蛋白表達(dá)顯著增加,ROS產(chǎn)生明顯增多,p-p38MAPK蛋白表達(dá)和p-p38MAPK/p38MAPK比值上調(diào)。結(jié)論:1.糖尿病腎病大鼠腎組織足細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加,伴隨著巨噬細(xì)胞浸潤顯著增多。2.高糖能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生促炎性M1型巨噬細(xì)胞活化,該M1型巨噬細(xì)胞激活足細(xì)胞ROS-p38MAPK信號通路進(jìn)而誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。3.高糖狀態(tài)下活化的M1巨噬細(xì)胞通過釋放TNF-α促炎因子,進(jìn)而激活足細(xì)胞ROS-p38MAPK信號通路誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：2768629