【摘要】：背景:隨著人民生活水平的提升,目前糖尿病(diabetic mellitus,DM)的發(fā)病率逐年升高,糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的最常見及最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,發(fā)病率亦逐年升高。目前對(duì)于DN的診斷,在臨床上一般需結(jié)合多年DM病史、臨床表現(xiàn)為不同程度的白蛋白尿、合并DM的其他并發(fā)癥(如糖尿病視網(wǎng)膜病變)等多方面指標(biāo)來進(jìn)行診斷,腎穿刺活檢術(shù)作為診斷疾病的金標(biāo)準(zhǔn),但由于其具有侵入性、損傷性等弊端,大多數(shù)DN患者較少接受此項(xiàng)檢查。DN患者一旦出現(xiàn)大量白蛋白尿,其病變會(huì)快速進(jìn)展,直至出現(xiàn)終末期腎臟病(end stage renal disease,ESRD)。因此尋找相對(duì)更早期、更具有特異性的DN診斷指標(biāo)具有重要價(jià)值。外泌體(exosome)作為一種細(xì)胞分泌的微小囊泡,攜帶大量生物學(xué)信息,而且外泌體具有的雙層膜結(jié)構(gòu)可以保護(hù)其內(nèi)容物,使相關(guān)的生物學(xué)信息得以更加穩(wěn)定的保存。目前已有許多文獻(xiàn)報(bào)道,外泌體在多種疾病的診斷及治療中具有重大的價(jià)值及意義。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)與結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)均為致纖維化相關(guān)基因,在DN的發(fā)生及進(jìn)展過程中起到重要作用,而且多種研究表明,上述兩種因子與足細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積等有密切的關(guān)系。目前已有研究通過比較DN患者和健康者血清或尿液中TGF-β1和CTGF基因的含量,發(fā)現(xiàn)DN患者血清或尿液中TGF-β1和CTGF基因表達(dá)升高,推測(cè)其表達(dá)對(duì)于早期診斷DN具有重要的意義。在本研究中通過檢測(cè)尿液外泌體中TGF-β1和CTGF基因的含量,尋找與DN之間的關(guān)系,為DN的早期診斷提供新的思路。目的:研究早期DN患者尿液外泌體中的致纖維化基因TGF-β1、CTGF的基因表達(dá)水平與健康人組的差異,以期發(fā)現(xiàn)早期DN的診斷標(biāo)記物。方法:本研究納入健康體檢者和早期DN患者各30例,收集入選者性別、年齡、吸煙史等一般資料,高血壓病史、收縮壓、舒張壓、蛋白尿、血尿、糖尿、尿微量白蛋白、空腹血糖、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、甘油三酯、膽固醇、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、血胱氨酸蛋白酶抑制劑C、血紅蛋白等臨床資料,將一般資料與臨床資料整理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有入選者均留取晨尿400ml,應(yīng)用差速超速離心法分離提取尿液中的外泌體,通過透射電鏡法(transmission electron microscope,TEM)、蛋白免疫印跡法(western blot,WB)鑒定外泌體。利用實(shí)時(shí)定量PCR法(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)檢測(cè)尿液外泌體中TGF-β1和CTGF的m RNA相對(duì)表達(dá)量,蛋白免疫印跡法檢測(cè)TGF-β1和CTGF的蛋白相對(duì)表達(dá)量。所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用Graphpad prism 6.0進(jìn)行制圖,p0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.健康體檢者共30例,男性14例(46.67%),女性16例(53.33%),男:女=0.875:1,平均年齡為51.57±7.81歲,DN組患者共30例,男性21例(70.00%),女性9例(30.00%),男:女=2.33:1,平均年齡為54.9±9.15歲,兩組在性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與健康體檢者比較,DN組患者的高血壓病史、收縮壓、舒張壓、蛋白尿、糖尿、尿微量白蛋白、空腹血糖、血尿素氮水平明顯升高(p0.05)。2.健康體檢者及DN患者尿液經(jīng)差速超速離心后,所得樣本在電鏡下觀察呈現(xiàn)為類圓形、直徑約40-100nm的“杯狀小體”,在WB實(shí)驗(yàn)中,外泌體標(biāo)記性蛋白CD9及TSG101蛋白呈陽性。3.與健康體檢組比較,DN組患者尿液外泌體中TGF-β1基因m RNA水平、蛋白含量明顯升高(p0.001)。4.與健康體檢組比較,DN組患者尿液外泌體中CTGF基因m RNA水平、蛋白含量明顯升高(p0.001)。結(jié)論:1.利用差速超速離心法,可從健康體檢者及早期DN患者尿液中成功分離出外泌體。2.DN組患者尿液外泌體中TGF-β1、CTGF的基因m RNA水平及蛋白含量均明顯高于健康體檢組,提示尿液外泌體中TGF-β1及CTGF的基因表達(dá)水平可以作為早期DN的診斷指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【圖文】：

壓、蛋白尿、糖尿、尿微量白蛋白、空腹血糖（p<0.05）。DN 組患者的空腹血糖為 9.83±2.mHg，舒張壓 89.50±12.10mmHg。將尿微量白液外泌體中的 TGF-β1、CTGF 的 mRNA 及蛋性回歸分析，并無明顯相關(guān)性（p>0.05）。具的鑒定速-超速離心法將外泌體從尿液中分離，得到行鑒定。鑒定外泌體沉淀置于透射電子顯微鏡下，觀察外泌體的形小體”，直徑大約在 40-100nm 之間，如圖 4.2.

、“杯口狀小體”，直徑大約在 40-100nm 之間，如圖 4.2.1。Western-Blot 法鑒定尿液外泌體標(biāo)記蛋白SG101 及 CD9 為外泌體特異性標(biāo)志蛋白，應(yīng)用 TSG101 及 CD9 單一抗，可得到如圖 4.2.2 中的條帶，證明樣品中存在外泌體。圖 4.2.1 尿液外泌體的電鏡鑒定圖片

25圖 4.3 A 為內(nèi)參基因 GAPDH 的擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖， B 為內(nèi)參基因 GAPDH 的熔解曲線圖，C 為目的基因 TGF-β1 的擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖， D 為目的基因 TGF-β1 的熔解曲線圖， E 為目的基因 CTGF 的擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖， F 為目的基因 CTGF 的熔解曲線圖。

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本文編號(hào)：2766984