【摘要】：背景與目的凋亡信號調(diào)節(jié)激酶 3(Apoptosis signal-regulating kinase,ASK3),是新近被證實的一種在腎臟高表達的蛋白激酶,在各物種間高度保守,又稱絲裂素活化蛋白激酶激酶激酶 15(Mitogen activated protein kinase kinase kinase 15,MAP3K15)。前期工作中,我們發(fā)現(xiàn)了一個特發(fā)性膜性腎病家系,具有AK3移碼突變,表現(xiàn)為腎病綜合征,病理證實為膜性腎病,免疫組化染色證實腎臟ASK3表達減少。研究表明ASK3在腎臟中主要表達于腎小管上皮細胞,通過WNK1-SPAK/OSR1-NCC/NKCC通路調(diào)控細胞容量,無ASK3對腎小球功能影響的相關(guān)研究。上述通路中 Odd-skipped related trannscription factor(Osr1)是中間中胚層早期表達的基因,與足細胞發(fā)育關(guān)系密切,在腎臟等器官形成中起重要作用。因此我們擬通過ASK3敲除(ASK3 knockout,ASK3-KO)小鼠探索ASK3對足細胞結(jié)構(gòu)和功能的作用;并探究ASK3缺失后,小鼠對阿霉素腎損害的易感性。研究方法1.對比9-10周齡雄性ASK3-KO小鼠、野生型(wild type,WT)小鼠,血壓、尿蛋白、血尿電解質(zhì)、血醛固酮、血生化指標、總腎重與體重比值,并在光鏡下觀察腎臟組織切片HE染色的改變,透射電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)改變。2.對7-8周齡雌性ASK3-KO小鼠、WT小鼠尾靜脈注射阿霉素(25mg/kg)誘導(dǎo)足細胞損害,對7-8周齡雌性ASK3-KO小鼠尾靜脈注射生理鹽水(12.5ml/kg)。觀察ASK3-KO小鼠是否較WT小鼠更易在阿霉素誘導(dǎo)后出現(xiàn)蛋白尿。3.獲取9-10周齡雄性ASK3-KO小鼠、WT小鼠的腎組織RNA,進行RNA-sequence及real-time PCR檢測,比較離子通道基因、足細胞相關(guān)基因的mRNA表達水平差異。研究結(jié)果1.ASK3-KO小鼠收縮壓顯著升高,24小時尿鈣總量明顯減低,p0.05;血鈉濃度、24小時尿鈉總量、血醛固酮水平無明顯差異。2.ASK3-KO小鼠腎重與體重的比值明顯減低,p0.05。尿白蛋白肌酐比(albumin/creatinine ratio,ACR)無顯著差異。光鏡下腎臟HE染色下未見異常,電鏡下見ASK3-KO小鼠腎臟存在足細胞足突局部融合。3.ASK3-KO小鼠中,第1天、第7天、第9天ACR,阿霉素注射組均顯著高于生理鹽水注射組,P0.05。注射阿霉素的ASK3-KO小鼠第7天ACR顯著高于注射阿霉素的WT小鼠第7天ACR,p0.05。4.腎組織RNA sequence分析顯示ASK3-KO組與WT組間共篩選出195個差異表達基因。尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(Plasminogen activator,urokinase receptor,PLAUR)基因在ASK3-K0組表達顯著下調(diào)。足細胞相關(guān)基因OSR1、PAX2、WT1、NPHS1 NPHS2、SULT1B1 Synapo,WNK1-SPAK/OSR1-NCC/NKCC通路基因及相關(guān)離子通道基因SPAK、WNK1/3/4、NCC、NKCC1、NKCC2、ENaC、NHE3、SGLT1均非差異表達基因。5.Real-time PCR提示ASK3-KO組與WT組間腎臟OSR1及NCC、NKCC1、NKCC2、ENaC、NHE3、SGLT1 mRNA表達無明顯差異,ASK3-KO組PLAUR表達明顯下調(diào),p0.05。結(jié)論我們首次證實ASK3-KO小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)足細胞足突局部融合;阿霉素注射后,ASK3-KO小鼠較WT小鼠更易出現(xiàn)蛋白尿。ASK3-KO小鼠腎臟PLAUR基因表達水平明顯下調(diào)。為研究ASK敲除小鼠足細胞結(jié)構(gòu)和功能研究提出了新線索。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R692
【圖文】：

部分：缺失對小鼠足細胞超微結(jié)構(gòu)和功能的影與方法逡逑驗材料逡逑動物：逡逑因敲除小鼠的構(gòu)建：ＡＳ７ＯＫ０小鼠獲贈于日本東京大學(xué)藥學(xué)研究院細胞信室Ｈｉｄｅｎｏｒｉ邋Ｉｃｈｉｊｏ教授。基因敲除小鼠構(gòu)建方法為同源重組法１３，示圖１。逡逑Ａ＾ａｌ邐Ａ＾ｉ邐叫邐Ａｐａ！逡逑

、ＸＳＸ３－Ｋ０小鼠體重、總腎重與體重比值逡逑ＡＳ／Ｇ－Ｋ０小鼠皮毛整齊光滑，活動自如，行為活潑，飲水進食無異常，體重隨逡逑周齡增長而逐漸增加，生殖能力未見異常，見圖２－Ａ。飼養(yǎng)時長最長至１８月齡，逡逑此時小鼠體型肥胖，活動尚可，飲水?dāng)z食無異常，外觀未見明顯異常。逡逑ＪＳＯ－ＫＯ組小鼠總腎重與體重的比值為０．０１４４邋±邋０．０００９，低于ＷＴ小鼠總腎逡逑重與體重的比值０．０１５９邋±邋０．０００８，并具有顯著性差異，ｐ＜０．邋０５，見圖２－Ｂ。逡逑Ａ邐０．０１８－Ｐ邐，邋Ｐ＿0Ｊ邋■，逡逑２８－ｊ邐二邐＊逡逑２０－邐？邋０．０１６－邐邐－＾５—逡逑ｆＺ邐Ｓ邐。邐卞逡逑盡１邋８－邐０．０１４－邐？？逡逑ｒ邐？逡逑ｏ－ｌ￣ｉ￣Ｉ￣Ｉ￣１￣Ｉ一一Ｉ￣１￣Ｉ——Ｉ邐０．０１２－Ｊ邐１邐１邐逡逑０１２３４５６７８９邐＾逡逑周數(shù)邐，邐，逡逑圖２．邋Ａ．邋ＺＳ／Ｍ０小鼠體重隨周齡變化（ｎ邋＝邋９）邋；邋Ｂ．小鼠總腎重與體重的比值逡逑（ＺＳ幻－Ｋ０邋小鼠，ｎ邋＝邋６；邋ＷＴ邋小鼠，ｎ邋＝邋７）逡逑二、小鼠血壓水平逡逑１１逡逑

１５．８４邋）邋ｍｍＨｇ，高于同齡對照組（５１．２８邋±邋８．３７邋）邋ｍｍＨｇ，但無顯著性差異。逡逑必幻－ＫＯ小鼠平均動脈壓（８０．９５邋±邋１３．１１邋）邋ｍｍＨｇ，高于同齡對照組（７０．８８邋士逡逑５．３０邋）邋ｍｍＨｇ，但無顯著性差異。見圖３。逡逑ｐ邋＝邋０．００４逡逑１５０－１邋Ｉ邋Ｉ逡逑Ｔ邐0邋ＷＴ邋ｍｉｃｅ逡逑１２0？邐Ｉ邐？邋ＡＳＫ３－ＫＯ邋ｍｉｃｅ逡逑Ｉ邋＿邋ｉ逡逑Ｅ邋９０－逡逑１邐ｓ邋ｉ邋ｔ逡逑６０－邐ｊ邐0逡逑３０－＊邐１邐１邐１邐逡逑悐邋多邋？逡逑圖３．邋／１ＳＯ－ＫＯ小鼠與ＷＴ小鼠收縮壓、平均動脈壓、舒張壓（ｙ４ＳＯ－Ｋ０小鼠，ｎ邋＝逡逑６；邋ＷＴ邋小鼠，ｎ邋＝邋６）逡逑＊邋ＳＢＰ邋＝邋ｓｙｓｔｏｌｉｃ邋ｂｌｏｏｄ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，邋文縮壓；ＭＡＰ邋＝邋ｍｅａｎ邋ａｒｔｅｒｉａｌ邋ｂｌｏｏｄ逡逑ｐｒｅｓｓｕｒｅ，平均動脈壓；ＤＢＰ邋＝邋ｄｉａｓｔｏｌｉｃ邋ｂｌｏｏｄ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，舒張壓；ＢＰ邋＝逡逑ｂｌｏｏｄ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，血壓逡逑三、ＡＳＤ－Ｋ０小鼠血尿電解質(zhì)、血醛固酮水平逡逑ＪＳＯ－Ｋ０小鼠２４小時尿鈣總量（１．６２邋土邋０．９６）邋ｎｍｏｌ明顯低于ＷＴ小鼠（２．８８逡逑土邋０．邋６６）ｙｍｏｌ，ｐ＜０．邋０５。ＡＳ７Ｍ０小鼠血鈣濃度稍高于野生型小鼠，但無顯著性逡逑差異。ＡＳＡ３－Ｋ０小鼠與ＷＴ小鼠在血鈉濃度、血氯濃度、血鉀濃度、血磷濃度

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本文編號：2765919