【摘要】：本論文包括三部分:(一)Alport綜合征的分子遺傳學(xué)研究;(二)SIOD的分子遺傳學(xué)研究;(三)Alport綜合征三家系的產(chǎn)前基因診斷。第一部分Alport綜合征的分子遺傳學(xué)研究研究背景:Alport綜合征(Alportsyndrome,AS)是一種臨床上以反復(fù)鏡下或肉眼血尿,慢性腎功能不全為主的進(jìn)行性遺傳性腎炎,常伴有眼部病變和高頻神經(jīng)性耳聾。IV膠原α 3 (COL4A3)、α 4 (COL4A4)、α 5 (COL4A5)基因突變是導(dǎo)致Alport綜合征病發(fā)的主要原因。本病的遺傳方式主要分為常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳和X-連鎖顯性遺傳。其中由IV膠原α 5突變導(dǎo)致的X-連鎖顯性遺傳是AS的主要遺傳方式,約占AS的85%。由于AS的致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5分別包含52、48和53個(gè)外顯子,且基因變異橫跨這三種膠原基因,故目前尚未發(fā)現(xiàn)存在突變熱點(diǎn)。AS是一種具有臨床異質(zhì)性的基底膜腎病,臨床診斷上有時(shí)易與薄基底膜腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化等腎臟疾病相混淆,造成誤診或漏診。目前第二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為AS的基因診斷奠定了基礎(chǔ),使得快速高效的對(duì)AS致病基因的定位和突變類型的篩查成為可能。研究方法:本文收集了 6個(gè)疑似或確診的AS的家系,利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)AS的致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5進(jìn)行突變篩查,通過PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序技術(shù)在家系中行突變位點(diǎn)的驗(yàn)證。對(duì)突變位點(diǎn)行序列同源性的比對(duì),觀察位點(diǎn)在進(jìn)化上的保守性。同時(shí)采用生物信息學(xué)的方法對(duì)突變是否具有致病性進(jìn)行分析。對(duì)于錯(cuò)義突變采用SIFT和Polyphen-2進(jìn)行有害性分析,采用MaxEntScan觀察剪切突變是否影響RNA的剪切。對(duì)200名正常對(duì)照行突變位點(diǎn)的測(cè)序,來排除突變位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)的可能性。研究結(jié)果:通過全外顯子組測(cè)序共檢測(cè)出5個(gè)新的突變和2個(gè)已知的致病突變,其中包括 2 個(gè)新的 c.4348CT (p.R1450X)、c. 352GA(p.G118R) CO4A3突變,2個(gè)COL A 新的突變 c.3455-2AG、c.3817GA(p.G1273S)和 2 個(gè)已知的致病突變 c.796CT (p.R266X)、c.2858GT (p.G953V),1個(gè)COL4A4的新的突變c.1099GA(p.G367S)。這些突變?cè)贏S家系中測(cè)序發(fā)現(xiàn)與疾病均呈共分離。同源性比對(duì)結(jié)果顯示突變位點(diǎn)在進(jìn)化上也是高度保守的。通過生物信息學(xué)對(duì)突變的致病性分析發(fā)現(xiàn),無論是錯(cuò)義突變還是剪切突變對(duì)AS均是有害突變,一旦突變將影響基因的功能。結(jié)論:本研究共發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)新的AS的致病基因進(jìn)一步豐富了突變數(shù)據(jù)庫,為疑似的AS從致病基因?qū)用孢M(jìn)行了確診,避免了誤診或漏診。進(jìn)一步揭示了基因診斷對(duì)臨床的具有重要意義,而致病基因的發(fā)現(xiàn)將為患者提供合理的預(yù)后治療,并為家族成員的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。第二部分SIOD的分子遺傳學(xué)研究研究背景:Schimke 免疫骨發(fā)育不良(Schimke immunoosseous dysplasia,SIOD)是一種臨床以脊柱骨骺發(fā)育不良(spondyloepiphyseal dysplasia,SED),身材矮小,T細(xì)胞缺乏,進(jìn)行性腎病綜合征和特殊面容為主要特征的罕見的常染色體隱性遺傳病。本病的發(fā)病率約為1:(100萬～300萬)。而SMARCAL1是目前SIOD唯一已知的致病基因,約有50%的患者無法檢測(cè)到其致病突變。SIOD是一種具有臨床異質(zhì)性的累及多個(gè)系統(tǒng)的疾病,臨床表現(xiàn)往往從輕度表型到嚴(yán)重表型不等。SMARCAL1基因突變中往往無義突變和錯(cuò)義突變居多,而錯(cuò)義突變易引起SIOD輕度的臨床表型,而無義突變及與其他類型的組合突變都易造成嚴(yán)重的SIOD表型的出現(xiàn)。目前與國(guó)外研究相比,國(guó)內(nèi)關(guān)于SIOD的研究還知之甚少。研究方法:本研究收集到一例臨床表型疑似SIOD的患者,利用PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)致病基因SMARCAL1基因行突變研究。然后對(duì)突變位點(diǎn)行序列同源性的比對(duì),觀察位點(diǎn)在進(jìn)化上的保守性。同時(shí)采用生物信息學(xué)的方法對(duì)突變是否具有致病性進(jìn)行分析。對(duì)于錯(cuò)義突變采用SIFT和Polyphen-2進(jìn)行有害性分析,采用MaxEntScan觀察剪切突變是否影響RNA的剪切。對(duì)200名正常對(duì)照行突變位點(diǎn)的測(cè)序,來排除突變位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)的可能性。研究結(jié)果:通過直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)SMARCAL1基因的突變c.1933CT,(p. R645C)和c.2450GA (p.R817H)。R645C突變來自臨床表型正常的母親,為已知的致病基因;而R817H為新的突變來源于臨床表型正常的父親。同源性比對(duì)結(jié)果顯示這兩個(gè)突變位點(diǎn)在進(jìn)化上也是高度保守的。生物信息學(xué)對(duì)突變的致病性分析發(fā)現(xiàn),R817H的錯(cuò)義突變SIFT軟件的預(yù)測(cè)值為0和Polyphen-2軟件預(yù)測(cè)值為1,此兩個(gè)的值都說明突變對(duì)SMARCAL1基因功能的正常發(fā)揮是有害的。結(jié)論:本研究共發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的復(fù)合的SMARCAL1基因突變導(dǎo)致SIOD的發(fā)生,進(jìn)一步豐富了SMARCAL 基因突變數(shù)據(jù)庫,并對(duì)研究中的疑似SIOD患者從致病基因?qū)用孢M(jìn)行了確診,避免了誤診或漏診。進(jìn)一步揭示了基因診斷對(duì)臨床的具有重要意義,而致病基因的發(fā)現(xiàn)將為患者提供合理的預(yù)后治療,并為家族成員的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。第三部分Alport綜合征三家系的產(chǎn)前基因診斷研究背景:Alport綜合征臨床表現(xiàn)最突出的是血尿,但是隨著年齡的增長(zhǎng)可出現(xiàn)少量蛋白尿甚至大量蛋白尿,并且最終逐漸進(jìn)展為腎功能衰竭從而需要進(jìn)行透析甚至腎臟的移植。然而目前Alport綜合征尚無有效的根治辦法且預(yù)后差,AS的產(chǎn)前診斷可以有效的避免患兒的再次出生以減輕家庭及國(guó)家的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。因此對(duì)于孕期的前期診斷尤其是產(chǎn)前基因診斷顯得尤為重要。研究方法:收集AS三家系先證者及其父母的外周血,并分別采集先證者孕期為18周、20周和20周的母親的羊水10ml。采用STR技術(shù)來排除母體細(xì)胞的污染,然后行PCR擴(kuò)增,再進(jìn)行DNA測(cè)序。研究結(jié)果:結(jié)果顯示三家系的母體細(xì)胞均無污染,經(jīng)過Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)家系Ⅰ的先證者母親羊水檢測(cè)尚未發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶同先證者相同的COL4A5基因c.1909CT (p.637QX)的雜合無義突變,可以正常分娩;而家系Ⅱ的先證者母親羊水檢測(cè)顯示胎兒攜帶有COL4A5基因c.1185-1186insC雜合插入移碼,選擇終止妊娠;家系Ⅲ的先證者母親羊水檢測(cè)顯示胎兒并不攜帶COL4A3基因c.2810GA和c.4793TG的復(fù)合突變,可以正常分娩。結(jié)論:若已知AS家系中的致病突變,那么分子診斷可以為AS家系的早期和精準(zhǔn)的產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692
【圖文】：

圖１．１邐基因結(jié)構(gòu)圖及兩突變的定位逡逑

對(duì)ＡＳ家系及疑似ＡＳ家系中所有先證者行全外顯子組測(cè)序。逡逑外顯子捕獲平臺(tái)（Ａｇｌｉｅｎｔ邋ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ外顯子耙向序列富集系統(tǒng)和ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ逡逑ＳｅｑＣａｐ邋ＥＺ人全外顯子捕獲系統(tǒng)）見圖２－７。逡逑實(shí)驗(yàn)步驟如下：逡逑１．

—ＺＺ７逡逑指導(dǎo)診斷及預(yù)后逡逑圖２＿８實(shí)驗(yàn)的技術(shù)路線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－８邋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｒｏｕｔｅ邋ｏｆ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑２２邋＇逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 丁潔;;Alport綜合征的診斷[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2010年04期

2 楊霽云,劉景誠;我國(guó)小兒腎小球疾病腎組織病理改變（2315例腎活檢材料的綜合分析）[J];中華兒科雜志;1996年05期

本文編號(hào)：2756116