【摘要】：目的:我們前期研究已經(jīng)證實肝再生增強因子(augmenter of liver regeneration,ALR)在缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)腎損傷中具有抑制腎小管上皮細胞凋亡作用,但其具體機制尚未完全闡明。本研究采用ALR-EGFP-3FLAG表達融合蛋白慢病毒載體轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細胞(HK-2)的方法,構(gòu)建穩(wěn)定過表達ALR的人腎小管上皮細胞株;觀察體外缺氧復(fù)氧(hypoxia reoxygenation,HR)處理對HK-2細胞線粒體動力學(mitochondrial dynamics)相關(guān)蛋白表達的影響,并探討過表達ALR對HR誘導(dǎo)HK-2細胞線粒體動力學的影響及作用機制。方法:將特異性過表達人23kD ALR的慢病毒Lv-ALR(ALR-EGFP-3FLAG)轉(zhuǎn)染HK-2細胞,慢病毒Lv-vector轉(zhuǎn)染HK-2細胞作為對照,通過觀察EGFP熒光和利用抗Flag抗體通過Western Blot檢測HK-2細胞中23kD ALR的蛋白表達情況對HK-2細胞進行篩選處理;采用Hank's平衡鹽溶液結(jié)合缺氧復(fù)氧(HR)的方法對HK-2細胞進行處理,模擬體內(nèi)IR腎損傷模型;實驗分為Normal組、IR組、Lv-vector+IR組、Lv-ALR+IR組。缺氧6h復(fù)氧12h刺激后,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。STRING v10預(yù)測蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。Western Blot檢測線粒體分裂關(guān)鍵蛋白Drp1、p-Drp1、MTFP1及相關(guān)信號通路蛋白mTOR、p-mTOR、4E-BP1、p-4E-BP1的蛋白水平。Western Blot檢測線粒體融合關(guān)鍵蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表達情況。結(jié)果:熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞GFP熒光表達豐度,感染效率約80%納入后續(xù)檢測。Western Blot檢測顯示,與Lv-vector組比較,Lv-ALR組細胞23 kD ALR蛋白得到有效表達(P0.05),與Lv-vector+IR組比較,Lv-ALR+IR組23 kD ALR蛋白同樣有效表達(P0.05);在H/R處理后6、12、24小時線粒體分裂關(guān)鍵蛋白Drp1表達逐漸上調(diào),于H6R12達峰值,且H6R24仍處于較高水平;流式細胞儀檢測顯示過表達ALR可抑制H/R誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡;與Lv-vector+IR組比較,Lv-ALR+IR組中Drp1和MTFP1表達均明顯下調(diào)(P0.05),并且過表達ALR也使p-Drp1 Ser637激活;與Lv-vector+IR組比較,Lv-ALR+IR組中線粒體分裂相關(guān)信號通路蛋白p-mTOR/mTOR、p-4E-BP1/4E-BP1比值明顯增高(P0.05);線粒體融合關(guān)鍵蛋白OPA1表達水平上升(P0.05),而Mfn1、Mfn2表達水平無明顯變化(P0.05)。結(jié)論:過表達23kD ALR可通過抑制線粒體分裂和促進線粒體內(nèi)膜融合對缺氧復(fù)氧處理腎小管上皮細胞線粒體具有保護作用,從而抑制腎小管上皮細胞凋亡,減輕腎IR損傷;其抑制線粒體分裂的作用途徑與活化mTOR/4E-BP1信號通路有關(guān)。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R692
【圖文】：

達肝再生增強因子的人腎小管上皮細胞株慢病毒相關(guān)信息由中國吉凱生物公司構(gòu)建，為獲取目的基因片段，87，帶 EGFP 熒光和 3FLAG 標簽（圖 1），同時將陰性對照。表 1 引物序列Tab1 Primer sequenceseq1)-P1 ATCGGGATCCCGCCACCATGGCGGC1)-P2 CGGGTACCGGTGTCACAGGAGCC

圖 2. IR 處理對 HK-2 細胞線粒體分裂的影響,與正常組比較*p < 0.05，**p < 0.01.Figure 2. Effects of IR treatment on mitochondrial fission in HK-2 cells, *p < 0.05 and **p <0.01 versus the normal group.3.2 過表達慢病毒轉(zhuǎn)染成功確定HK-2 細胞轉(zhuǎn)染過表達 ALR 慢病毒 72 小時后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率約 80%以上的細胞組初步納入后續(xù)實驗；利用抗 Flag 抗體通過 Western blot 檢測ALR 蛋白表達情況。我們同時也檢測了經(jīng) I6R12 處理的轉(zhuǎn)染過表達慢病毒 HK-2細胞的 ALR 蛋白表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了慢病毒的 HK-2 細胞中 23kD ALR 都得到了有效表達（圖 3）。

圖 3. 過表達慢病毒轉(zhuǎn)染成功確定, 與 Lv-vector 組或 Lv-vector+IR 相比** P< 0.01.Figure 3. The determination of successful transfection of the ALR-containing lentiviralparticles, **P<0.01, as compared with the Lv-vector group or the Lv-vector+IR group.3.3 過表達 ALR 對 IR 處理 HK-2 細胞凋亡的影響線粒體分裂與細胞凋亡緊密相關(guān)。本研究通過流式細胞儀檢測 HK-2 細胞凋亡率。根據(jù)別藻藍素(APC)和增殖染料 eFluor 450 (PB450-A)的染色情況，凋亡細胞群組成如下：活細胞(APC 和 PB450-A )、早期凋亡細胞(APC 和 PB450-A +)、晚期凋亡細胞(APC +和 PB450-A +)和壞死細胞(APC +和 PB450-A -)。將早期凋亡細胞及晚期凋亡細胞一起納入為總的凋亡細胞水平。與 Lv-vector+IR 組相比，Lv-ALR+IR 組的細胞凋亡率明顯下降(9.74±1.15% vs. 26.88±2.66%, p < 0.01)，提示過表達 ALR 可以抑制 IR 誘導(dǎo)的 HK-2 細胞發(fā)生凋亡（圖 4）。

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本文編號：2754484