【摘要】：糖基化修飾,是人體內(nèi)蛋白質(zhì)最普遍的修飾方式之一。N聯(lián)糖基化修飾普遍存在于細(xì)胞外蛋白,比如體液蛋白、分泌蛋白、細(xì)胞膜蛋白等。精漿是精子(細(xì)胞)生存的外部環(huán)境,主要由睪丸和附屬性腺分泌,富含體液蛋白和分泌蛋白,據(jù)此推測(cè)精漿中應(yīng)該富含N聯(lián)糖基化修飾的蛋白質(zhì)。精漿樣本相對(duì)容易獲取,精漿中蛋白含量較血液和尿液更豐富,通過質(zhì)譜和其他檢測(cè)技術(shù)可以進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。這都提示精漿N聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)有潛力作為男性生殖系統(tǒng)疾病的無創(chuàng)性診斷標(biāo)記物,有助于疾病的早期篩查和輔助診斷。糖基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響,可以通過糖與碳水化合物相互作用,調(diào)控細(xì)胞粘附與識(shí)別,參與細(xì)胞間,細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用。精漿糖基化蛋白質(zhì)正是通過這些功能調(diào)控精子在女性生殖道的運(yùn)輸以及與卵子的結(jié)合。已知有為數(shù)不多的精漿蛋白被鑒定為N聯(lián)糖基化蛋白,例如PSA、Glycodelin S、FN1、SEMG等,研究發(fā)現(xiàn)這些蛋白不同程度參與了男性生殖功能。雖然精漿中糖基化蛋白有非常重要的功能和臨床意義,但我們對(duì)人類精漿N聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)整體構(gòu)成和功能的了解仍然有限,值得關(guān)注和開展研究。本項(xiàng)研究第一部分構(gòu)建了一個(gè)高度可信的人類精漿N聯(lián)糖基化修飾蛋白質(zhì)譜系。構(gòu)建糖基化蛋白質(zhì)譜系方法為運(yùn)用凝集素富集N聯(lián)糖基化肽段,然后使用糖肽酶切割富集肽段結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜掃描�？紤]到個(gè)體間糖基化蛋白質(zhì)可能存在差異,進(jìn)行了5次生物學(xué)重復(fù)鑒定(標(biāo)本均來源自正常生育人群且精液參數(shù)正常),結(jié)果表明正常人群精漿N-糖基化蛋白質(zhì)構(gòu)成大致相似。本次研究共鑒定到372個(gè)糖基化蛋白和720個(gè)糖基化位點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究精漿中糖蛋白的功能,利用ToppGene軟件進(jìn)行GO與KEGG功能學(xué)分析。372個(gè)鑒定到的糖基化蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)到365個(gè)Entrez基因。精漿糖基化蛋白主要富集在細(xì)胞外區(qū)域(138基因)、溶酶體(76個(gè)基因)、細(xì)胞膜(61個(gè)基因),其中43%(160個(gè)蛋白)是分泌蛋白,最顯著的生物進(jìn)程與細(xì)胞粘附有關(guān)(涉及78個(gè)基因),功能分析提示精漿糖基化蛋白質(zhì)可能調(diào)控精液凝固與液化,精子運(yùn)動(dòng)與獲能,并參與精卵識(shí)別與融合。比較本研究與已發(fā)表男性生殖系統(tǒng)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn),我們鑒定到的糖基化蛋白質(zhì)有11個(gè)是附睪特異性,10個(gè)是睪丸特異性,4個(gè)是精囊特異性,3個(gè)是前列腺特異性,提示這些糖基化蛋白可以作為生殖系統(tǒng)和不育癥的診斷標(biāo)記物。研究的第二部分著重觀察精漿糖基化蛋白質(zhì)和生化指標(biāo),精子參數(shù)對(duì)精子前向運(yùn)動(dòng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)弱精組較正常組的精子濃度(64.6±33.8 VS88.4±44.1)×106/ml,正常形態(tài)率(9.4±5.3 VS 12.9±5.6)%明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明精子前向運(yùn)動(dòng)與精子濃度和形態(tài)密切相關(guān)。精漿果糖濃度與精子前向運(yùn)動(dòng)比例(r=0.21),精子總活力(r=0.25)均呈正相關(guān),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們挑選4個(gè)精漿糖基化蛋白質(zhì)(LTF,FN1,SEMG2,WFDC2)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTF和精子前向運(yùn)動(dòng)有相關(guān)性,精漿中LTF表達(dá)量在弱精組較正常組明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。LTF由精囊腺和前列腺分泌,提示附屬性腺分泌不足影響精子前向運(yùn)動(dòng)。第二部分研究結(jié)果表明精子本身質(zhì)量在精子前向運(yùn)動(dòng)發(fā)揮基本作用,這由睪丸生精功能決定的;而附屬性腺分泌的精漿蛋白如糖基化蛋白發(fā)揮重要調(diào)控功能。進(jìn)一步的研究可以觀察體外添加LTF對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的影響,探討精漿中LTF分泌的影響因素和調(diào)控精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R698.2
【圖文】：

20圖 1：人類精漿 N 聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)的特征，及與其他已知糖蛋白的對(duì)比。（A）五次生物學(xué)重復(fù)鑒定的 N 聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)覆蓋率；（B）五次生物學(xué)重復(fù)鑒定的 N 聯(lián)糖基化位點(diǎn)覆蓋率；（C）用 MotifX. WebLogo 3 衍生的 N 聯(lián)糖基化相對(duì)頻率圖及共有序列；（D）精漿糖基化蛋白質(zhì)譜中蛋白質(zhì)上分布的 N 聯(lián)糖基化位點(diǎn)數(shù)目。Rolland 等總結(jié)了既往的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，總結(jié) 2545 種不同的人類精漿蛋白質(zhì)[40]。在這些蛋白質(zhì)中，我們的研究表明其中 263 個(gè)為糖基化蛋白質(zhì)（圖2A）。在我們的糖基化蛋白質(zhì)譜系，109 個(gè)糖基化蛋白質(zhì)是第一次被鑒定到，在以往的精漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫中沒有提及。糖基化位點(diǎn)的周圍序列（二端各6 個(gè)氨基酸）是糖基化修飾的調(diào)控序列，在 dbPTM 數(shù)據(jù)庫中，通常用這些調(diào)

我們的研究表明其中 263 個(gè)為糖基化蛋白質(zhì)（圖2A）。在我們的糖基化蛋白質(zhì)譜系，109 個(gè)糖基化蛋白質(zhì)是第一次被鑒定到，在以往的精漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫中沒有提及。糖基化位點(diǎn)的周圍序列（二端各6 個(gè)氨基酸）是糖基化修飾的調(diào)控序列，在 dbPTM 數(shù)據(jù)庫中，通常用這些調(diào)

釗湎嗷プ饔霉叵怠?6 個(gè)基因通過 147 個(gè)相互作用關(guān)聯(lián)(圖3A)。關(guān)聯(lián)最多的基因是 FN1（22 個(gè)相互關(guān)聯(lián)基因），其次是 TGFB1（19 個(gè)相互關(guān)聯(lián)基因），其他還有比如 CLU，SERPINA1，TIMP1 也都與其他糖基化蛋白質(zhì)有廣泛的相互作用關(guān)系。

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本文編號(hào)：2747677