【摘要】：研究背景：糖尿病腎病是糖尿病的并發(fā)癥之一,治療手段有限,亟待拓展。越來(lái)越多的研究表明腎臟局部慢性炎癥是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的重要因素,但其分子機(jī)制還未明確。有研究提示炎癥小體(NLRP3)、microRNA等炎癥相關(guān)因素可能在多個(gè)層面影響著糖尿病腎病炎癥狀態(tài)的發(fā)生,作為胰島素抵抗的推手,促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生。我們前期實(shí)驗(yàn)已表明倍半萜內(nèi)酯(PTN)可緩解db/db小鼠模型糖尿病腎病臨床和病理,降低MCP-1、IL-6等炎癥因子表達(dá)及改善局部胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。本文旨在探討糖尿病腎病患者及db/db鼠DKD模型腎臟局部是否存在微炎癥狀態(tài),探究PTN如何從基因?qū)用�、蛋白水�?通過(guò)直接抑制NF-κB、NLRP3,抑制腎臟局部的慢性炎癥發(fā)生,延緩糖尿病腎病進(jìn)展提供理論依據(jù)。 研究目的：了解糖尿病腎病患者腎臟局部炎癥狀態(tài),觀察巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥小體(NLRP3)、NF-κB在腎臟表達(dá)變化。利用db/db小鼠模型研究糖尿病腎病中NLRP3、NF-κB通路及microRNA譜變化情況,探究PTN對(duì)腎臟局部微炎癥的影響,延緩糖尿病腎病的可能機(jī)制。研究方法：(1)篩選2011年1月至2014年1月北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科住院經(jīng)腎穿刺病理活檢確認(rèn)為糖尿病腎病的患者37例,其中7例糖尿病病史短,病理僅有腎小球肥大,記為DKD1組,其余記為DKD2組。收集同期微小病變(CTL1)10例及膜性腎病患者(CTL2)15例與DKD組進(jìn)行比較。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)CD68、NF-κB、炎癥小體(NLRP3)表達(dá)情況以確認(rèn)有無(wú)慢性炎癥現(xiàn)象。(2)利用前期動(dòng)物模型,分別取實(shí)驗(yàn)小鼠三組[對(duì)照組(db/m+NS)、糖尿病組(db/db+NS)、PTN干預(yù)組(db/db+PTN)],T0(8周齡)、T4(12周齡)及T8(16周齡)留取腎臟標(biāo)本。利用T8腎臟組織進(jìn)行深度測(cè)序,查看db/db小鼠microRNA表達(dá)譜變化及PTN對(duì)其影響,并對(duì)于差異表達(dá)最大的microRNA146a-5p給與實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。(3)利用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)方法、免疫酶聯(lián)吸附法驗(yàn)證IRAK1蛋白、TRAF6蛋白、IK B蛋白、NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1的表達(dá)情況,初步探討PTN干預(yù)小鼠糖尿病腎病可能的機(jī)制。 研究結(jié)果：糖尿病腎病早期的患者腎臟局部與對(duì)照組相比,可見(jiàn)肥大的腎小球中、腎間質(zhì)、腎小管局部CD68陽(yáng)性,OD值為(6.9±6.7)‰,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05；而糖尿病中晚期患者腎小球、腎小管、腎間質(zhì)存在大量片狀分布的CD68陽(yáng)性胞漿,OD值(16.7±7.9)‰,與對(duì)照組(CTL1、CTL2)、糖尿病初期組比較,差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。與CD68結(jié)果一致,NLRP3及NF-κB表達(dá)也隨著糖尿病腎病病情而加重。NF-κB在DKD1期組、DKD2組OD值分別(5.4±1.8)%、(12.7±8.0)%,分別與CTL1或CTL2組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。NLRP3在DKD1組、DKD2組OD值分別(15.8±7.7)%、(18.6±7.7)%,DKD2組與對(duì)照組(CTL1、CTL2)及DKD1組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,糖尿病腎病組(db/db+NS)與對(duì)照組(db/m+NS)相比,表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的microRNA數(shù)目分別為206個(gè)和91個(gè),糖尿病腎病組(db/db+NS)與干預(yù)組(db/db+PTN)相比表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的microRNA分別為101個(gè)和76個(gè)。在一定表達(dá)量的前提下,同時(shí)滿足在糖尿病腎病組(db/db+NS)下調(diào)而干預(yù)組(db/db+PTN)中上升的microRNA有68個(gè),前5位依次為：microRNA146a-5p、 microRNA223-3p、microRNA16-5p、microRNA126-3p、microRNA195-5p。在一定表達(dá)量的前提下,同時(shí)滿足在糖尿病組上調(diào)而干預(yù)組中下調(diào)的microRNA共72個(gè),其中前5位的依次為：microRNA204-5p、microRNA7d-3p、microRNA2137、 microRNA5115、microRNA193b-3p。它們與炎癥、腫瘤、血管生成等密切相關(guān)。microRNA146a-5p在db/db模型小鼠中表達(dá)量降低最顯著,且干預(yù)組中能夠恢復(fù)最明顯,對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR功能驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病組(db/db+NS)與同周齡的對(duì)照組(db/m+NS)相比,microRNA146a-5p表達(dá)量降低,且隨周齡增加而表達(dá)量減少,糖尿病腎病組(db/db+NS)vs對(duì)照組(db/m+NS)△CT值分別為：T0：0.62±0.43vs0.82±0.44；T4：0.42±0.38vs0.92±0.64；T8：0.34±0.12vs0.86±0.68,T8具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干預(yù)組(db/db+PTN)與同周齡糖尿病腎病組(db/db+NS)相比表達(dá)量增多,db/db+PTN組vs db/db+NS組的△CT值分別為：TO：0.69±±0.42vs0.62±0.43；T4：1.07±0.96vs0.42±±0.38；T8：0.72±0.53vs0.34±0.12,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但T4及T8組microRNA146a-5P表達(dá)量均較糖尿病組升高一倍以上。 在對(duì)照組(db/m+NST0、T4、T8)中,小鼠的IRAK1mRNA、TRAF6mRNA、IRAKl蛋白、TRAF6蛋白、pho-IκB蛋白表達(dá)量均處于同一較低水平。糖尿病組(db/db+NS)與對(duì)照組(與db/m+NS)相比,表達(dá)量升高,且隨著周齡增加而表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而干預(yù)組(與db/db+PTN)和糖尿病組((ib/db+NS)相比,各蛋白表達(dá)量下降。IκB作為NF-κB抑制蛋白,在IκB免疫組織化學(xué)染色中可見(jiàn)對(duì)照組(db/m+NS TO)、糖尿病組(db/db+NS TO)及干預(yù)組(db/db+PTNTO)有IκB在腎小管穩(wěn)定表達(dá),而隨著db/db小鼠周齡的增加,db/db小鼠IκB逐漸消失,而PTN干預(yù)后IκB在腎小管逐漸表達(dá)。NF-κB與之相反,在對(duì)照組(db/m+NS TO、T4、T8)、糖尿病組(db/db+NS TO)有NF-κB在腎小管少量表達(dá),而隨著周齡增加,db/db+NS組小鼠NF-κB表達(dá)逐漸升高,主要在腎小管、腎間質(zhì)區(qū)域。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)PTN干預(yù)后,陽(yáng)性區(qū)域減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 對(duì)照組(db/m+NS TO)、糖尿病組(db/db+NS TO)、干預(yù)組(與db/db+PTNTO)小鼠的NLRP3mRNA及Western Bloting表達(dá)量處于較低水平,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在基因表達(dá)層面及蛋白質(zhì)層面均證實(shí)db/db+NS隨周齡增長(zhǎng),NLRP3表達(dá)增加,T4及T8的mRNAΔΔCT糖尿病組(db/db+NS)vs對(duì)照組(db/m+NS)為：T40.82±0.52vs0.43±0.36;T81.29±0.35vs0.66±0.22。經(jīng)PTN干預(yù)NLRP3表達(dá)量下降,mRNAΔΔCT干預(yù)組(db/db+PTN)vs糖尿病組(db/db+NS)為：T40.53±0.21vs0.82±0.52；T8：0.71±0.26vs1.29±0.35,后者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。Caspase-1蛋白表達(dá)結(jié)果與NLRP3一致,其中對(duì)照組(db/m+NST0)、糖尿病組((Ib/db+NS TO)、干預(yù)組(與db/db+PTN TO)小鼠Caspase-1蛋白表達(dá)量處于較低水平。糖尿病組比對(duì)照組表達(dá)升高,△△CT值為T4：1.50±0.19vs1.13±±0.24；T8::1.33±±0.25vs1.02±0.21,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而PTN干預(yù)下可見(jiàn)Caspase-1蛋白表達(dá)降低,db/db+PTN組vs db/db+NS組無(wú)△△CT為：T41.19±0.39vs1.50±0.19,T80.75±0.05vs1.33±0.25,后者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1mRNA表達(dá)上,db/db+NS同樣表現(xiàn)出隨周齡升高,而表達(dá)增高的特點(diǎn),但在干預(yù)組(db/db+PTN T8)mRNA表達(dá)未降低,其△△CT為2.82±0.06。而在IL-1WB與ELISA結(jié)果一致。隨著周齡增加,db/db+NS組IL-1表達(dá)量逐漸升高,而PTN干預(yù)后,水平降低趨勢(shì)。 研究結(jié)論：在糖尿病腎病的患者及db/db小鼠糖尿病腎病模型中均存在腎臟局部慢性炎癥狀態(tài)。db/db小鼠糖尿病腎病模型中有NF-κB通路及NLRP3通路各蛋白表達(dá)的增加。db/db小鼠糖尿病腎病模型存在microRNA譜的變化,尤其是nmicroRNA146a-5p表達(dá)下調(diào)。在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,microRNA146a-5p被抑制,NF-κB通路及NLRP3通路被激活,可能是重要的組成部分。PTN干預(yù)后,促進(jìn)microRNA146a-5p表達(dá)、同時(shí)抑制NF-κB、NLRP3表達(dá),進(jìn)一步起到抑制糖尿病腎病局部炎癥,延緩疾病進(jìn)展的。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R587.2;R692
【圖文】：

胰島素分泌通路（mmu04910:Insulin signaling pathway)、1條指樣受體通mmu04620:Toll-like receptor signaling pathway)、1 條 mTOR 通路mu04150:mTOR signaling pathway)、1 條趨化因子通路mu04062:Chemokine signaling pathway)。如圖 2-2 及 2-3 所示。而糖尿病腎�。╠b/db+NS)較對(duì)照組上調(diào)、PTN干預(yù)后下降的通路共68詳見(jiàn)圖3。其中排在前10位的分別是：腫瘤通路（mmu05200:Pathways iner)、神經(jīng)軸突導(dǎo)向通路（mmu04360:Axon guidance)、粘附通路mu04510;Focal adhesion)、神經(jīng)信號(hào)通路（mnui04722:Neurotrophin signalingway)、MAPK 信號(hào)通路（mmu04010:MAPK signaling pathway)、腎細(xì)胞路（mmu0521 l:Renal cell carcinoma)、Wnt 信號(hào)通路（mmu04310:Wntaling pathway)、胰島素分泌通路（mmu04910:Insulin signaling pathway)。roRNA與祀基因的網(wǎng)狀關(guān)系，如圖2-4所示。圖2糖尿病腎病下調(diào)而干預(yù)組恢復(fù)的

本文編號(hào)：2745085