【摘要】：背景:缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)是同種異體腎移植功能延遲的常見原因之一,并且與移植后長期腎功能不良有關(guān)。在腎移植以及其他手術(shù)過程中,如腎結(jié)石手術(shù),腎腫瘤的實(shí)質(zhì)保留手術(shù)和腎動脈手術(shù)等,會發(fā)生完全和長時間的腎動脈血流中斷。而長期腎缺血是導(dǎo)致急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)的主要原因。缺血和再灌注期間發(fā)生各種生物化學(xué)變化,包括活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)釋放、細(xì)胞凋亡、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤和炎性介質(zhì)釋放,這可導(dǎo)致腎組織損傷。由于腎IRI的病理生理過程復(fù)雜,且具有高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn),因此研究者積極尋找新的治療策略來降低急性死亡率和預(yù)防AKI進(jìn)展為慢性腎衰竭。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplamic Reticulum,ER)是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的細(xì)胞器,負(fù)責(zé)細(xì)胞膜和分泌蛋白的合成和折疊,還可以作為Ca2+儲存器。由于不利的局部環(huán)境異常,例如Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞、缺氧、病毒或細(xì)菌感染,均可以干擾蛋白質(zhì)的正常折疊,導(dǎo)致未折疊蛋白的蓄積,誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplamic Reticulum Stress,ERS)。在ERS的情況下,未折疊蛋白在ER蓄積是物種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞自適應(yīng)的結(jié)果,稱為未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response,UPR)。哺乳動物細(xì)胞的ER有三個關(guān)鍵的跨膜蛋白感受器參與UPR,包括轉(zhuǎn)錄活化因子 6(Activating Transcription Factor 6,ATF6)、肌醇需要酶 1(Inositol-Requiring Enzyme 1α,IRE1α)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKRP-likeERKinase,PERK)。在靜息狀態(tài)下,上述三個感受器與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose Regulated Protein78,GRP78)/免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Binding Immunoglobulin Protein,BiP)結(jié)合而失去活性。當(dāng)ER中錯誤折疊蛋白積累,BiP與感受器解離,與未折疊蛋白結(jié)合而激活,產(chǎn)生PERK/eIF2α、IRE1α/XBP1s和ATF6/ERSE三條主要的信號通路。隨后,ATF6移動到高爾基體,并被S1和S2蛋白酶切割,具有DNA結(jié)合域的胞質(zhì)裂解片段(ATF6n)遷移到細(xì)胞核內(nèi),激活編碼ER分子伴侶蛋白,促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、成熟、分泌及ER相關(guān)降解(ER-associated degradation,ERAD)等基因的轉(zhuǎn)錄。GRP78表達(dá)上調(diào)是證實(shí)UPR發(fā)生的標(biāo)志蛋白。由此可見,UPR可以維持ER功能,有利于細(xì)胞從應(yīng)激中恢復(fù),并可對額外應(yīng)激提供“適應(yīng)性”反應(yīng)。然而,持續(xù)或延長的ERS是有害的,可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是腎IRI期間細(xì)胞死亡的主要形式,甚至可以獨(dú)立于炎癥并影響器官的功能。缺血可誘導(dǎo)腎小管任何節(jié)段的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的途徑包括PERK,C/EBP同源蛋白(C/EBP Homologous Protein-10,CHOP)的誘導(dǎo),以及IRE1a激酶/RNase活化。后者可導(dǎo)致腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor 2,TRAF2)活化,細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶 1(Apoptosis Signal-regulating Kinase 1,ASK1)和c-Jun氨基末端激酶(JunN-terminal Kinase,JNK)的激活。大量的研究已證實(shí),ERS是缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)誘導(dǎo)的AKI的機(jī)制之一。I/R損傷誘導(dǎo)腎臟的ERS,包括誘導(dǎo)XBP1剪接及GRP78上調(diào),主要發(fā)生在近曲小管上皮細(xì)胞。其中IRE1α/XBP1是ERS發(fā)生十分重要的一條信號通路,主要參與脂質(zhì)合成,ERAD,蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌。IRE1a在正常情況下保持無活性狀態(tài);當(dāng)ERS狀態(tài)下,IRE1發(fā)生二聚化,進(jìn)而發(fā)生自身磷酸化被激活。IRE1是XBP1的上游調(diào)節(jié)子,介導(dǎo)pre-XBP1mRNA的剪接。XBP1具有XBP1s和XBP1u兩種形式。研究表明,只有剪接形式的XBP1(XBP1s)可以誘導(dǎo)有效的UPR。有數(shù)據(jù)表明,膿毒血癥誘導(dǎo)ERS的發(fā)生,激活I(lǐng)RE1-NF-κB通路,通過近端腎小管上皮細(xì)胞促炎癥因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)產(chǎn)物的增加來加速膿毒血癥AKI的發(fā)生。由此可見,ERS可以激活NF-κB。NF-κB是TNF-α,IL-1β和IL-6等炎癥因子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。大量的證據(jù)表明,NF-κB的激活可以導(dǎo)致促炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄,觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),在腎IRI中起到關(guān)鍵作用。一些研究已經(jīng)確定,某些小分子抑制劑可選擇性地阻斷IRE1/XBP1的激活,從而減輕ERS導(dǎo)致的組織損傷。IRE1有兩個主要位點(diǎn)已被確定作為開發(fā)抑制劑的靶向目標(biāo):核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域的催化核心和激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)。靶向核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域的小分子物質(zhì)包括:水楊酸醛、4 μ8C、MKC-946、STF803010等。STF083010是一種新的IRE1/XBP1抑制劑,通過抑制IRE1α的核糖核酸酶活性來抑制XBP1mRNA剪接,而不影響IRE1α的磷酸化過程,從而降低XBP1s蛋白水平,具有潛在的抑制長時間ERS的作用,防止細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。研究證實(shí),STF83010具有顯著的抗骨髓瘤,重建乳腺癌MCF7-TAMR細(xì)胞對他莫昔芬治療的敏感性以及減少創(chuàng)傷后應(yīng)激大鼠藍(lán)斑部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。因此,我們將XBP1抑制劑STF083010應(yīng)用于腎IRI,觀察其對腎IRI的作用,并初步探討其可能的機(jī)制。目的:探討XBP1抑制劑STF083010在腎缺血再灌注損傷過程中的作用及可能機(jī)制。方法:雄性SD(Sprague Dawley)大鼠24只,體重(150-200)克,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham),缺血再灌注組(Model),STF083010組,Mock組,每組6只大鼠。Sham組:大鼠開腹后,僅分離雙側(cè)腎動脈而不夾閉。Model組:大鼠開腹后,分離雙側(cè)腎動脈,無創(chuàng)血管夾同時夾閉腎動脈40分鐘后放開血管夾進(jìn)行再灌注。STF083010組:應(yīng)用DMSO將STF083010試劑進(jìn)行完全溶解后,使用生理鹽水稀釋為濃度3毫克/毫升,術(shù)前1小時按照15毫克/公斤的劑量進(jìn)行腹腔注射。Mock組:術(shù)前1小時按照0.5毫升DMSO的劑量進(jìn)行腹腔注射。各組SD大鼠以再灌注開始時間為標(biāo)準(zhǔn),24h后處死大鼠,應(yīng)用留置針于腹主動脈采血4毫升放入促凝管中,以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后,留取血清-80 ℃低溫冰箱凍存。立即用0.9%氯化鈉注射液通過腹主動脈沖洗雙腎,直至雙腎顏色由紅變白,摘下兩腎分塊處理后-80 ℃低溫冰箱凍存?zhèn)溆�。第一部�?觀察各組大鼠腎組織形態(tài)和生化指標(biāo)的變化。各組HE染色,血清肌酐(Serum Creatinine,Scr)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)檢測。第二部分:觀察STF083010對腎IRI炎癥途徑的影響。檢測各組腎組織髓過氧化物酶(MPO)活性;ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β的水平;免疫組化檢測腎組織XBP1s、NF-κBp65蛋白情況;RT-PCR檢測腎組織XBP1s、XBP1u的mRNA 表達(dá)量情況;Western blot 檢測腎組織 XBP1s、GRP78、pIRE1、NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況。第三部分:觀察STF083010對腎IRI凋亡途徑的影響。TUNEL法檢測各組腎組織細(xì)胞凋亡情況;免疫組化檢測腎組織CHOP蛋白情況;Western blot檢測腎組織CHOP和cleaved Caspase 3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.本研究顯示:大鼠 Model 組 Scr(136.48±28.70)umol/l 和 BUN(38.59±7.79)mmol/l,較 Sham 組 Scr(61.48±11.67)umol/1 和 BUN(7.88±2.30)mmol/1 明顯升高,差異有顯著性(p0.05)。Model組大體標(biāo)本可見腎臟體積增大,髓質(zhì)淤血,顏色晦暗,皮質(zhì)顏色較蒼白。HE染色光鏡下可見腎小球損傷輕微,主要以腎小管損傷為主,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,水樣變性,出現(xiàn)不同程度壞死,脫落細(xì)胞較多,可見管型;間質(zhì)有充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤。Model組腎小管壞死評分明顯升高,與Sham組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。從生化和病理形態(tài)學(xué)上證實(shí)缺血再灌注模型成功建立。2.大鼠腎I/R造模前應(yīng)用STF083010處理后發(fā)現(xiàn):STF083010組Scr(78.97±14.35)umol/l 和 BUN(17.45±3.72)mmol/l,顯著低于 Model 組 Scr(136.48 ±28.70)umol/1 和 BUN(38.59±7.79)mmol/l(p0.05)。光鏡下 STF083010 組與 Model組相比,腎小管上皮細(xì)胞腫脹明顯減輕,偶見小管上皮細(xì)胞壞死及細(xì)胞脫落,間質(zhì)水腫及炎細(xì)胞浸潤減輕。腎小管壞死評分明顯降低(p0.05)。證明了STF083010可以減輕腎臟功能損傷及改善腎組織形態(tài)損傷。3.免疫組化顯示:Model組的NF-κB p65及XBP1s主要分布在皮髓質(zhì)交界區(qū),尤其是近端腎小管的區(qū)域。ELISA結(jié)果顯示:與Sham組相比,Model組血清TNF-α、IL-1β的水平明顯升高(p0.05)。MPO活力結(jié)果顯示:與Sham組相比,Model組MPO活力明顯升高(p0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:Model組XBP1s mRNA水平顯著升高,XBP1s/XBP1u mRNA比值8.69,較Sham組增加了 7.69倍。Western blot結(jié)果顯示:Model組XBP1s、pIRE1、GRP78和NF-κB p65(細(xì)胞核內(nèi))蛋白表達(dá)水平較Sham組明顯升高,差異具有顯著性(p0.05)。這說明,I/R損傷后炎癥介質(zhì)升高,誘發(fā)了 ERS,啟動了 UPR。IRI時,細(xì)胞漿內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低,而細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白表達(dá)水平升高。證實(shí)了 I/R損傷導(dǎo)致NF-κB p65活化。大鼠腎I/R造模前應(yīng)用STF083010處理后發(fā)現(xiàn):與Model組相比,STF083010組XBP1s及NF-κB p65在皮髓質(zhì)交界區(qū)的表達(dá)顯著降低(p0.05)。血清TNF-α、IL-1β的水平明顯降低(p0.05)。MPO活力明顯降低(p0.05)。STF083010 組 XBP1s/XBP1u mRNA 比值降低,兩者之比 2.74。XBP1s、pIRE1、GRP78和NF-κB p65(細(xì)胞核內(nèi))蛋白表達(dá)水平明顯降低(p0.05)。證實(shí)了 STF083010可以通過抑制ERS減輕腎I/R誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。4.與Sham組相比,Model組凋亡指數(shù)明顯升高,凋亡主要集中在近曲小管上皮細(xì)胞和遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞;而STF083010組凋亡指數(shù)明顯降低(p0.05)。因此,證實(shí)了腎I/R導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,且STF083010具有減少細(xì)胞凋亡的作用。免疫組化顯示:與Sham組相比,Model組CHOP表達(dá)水平明顯增加,主要分布在皮質(zhì)區(qū)的腎小管上皮細(xì)胞。STF083010組CHOP表達(dá)水平較Model組明顯降低(p0.05)。Western blot 顯示:STF083010 組 CHOP 和 cleaved Caspase 3 蛋白表達(dá)水平較Model組明顯降低(p0.05),與TUNEL結(jié)果符合。以上提示,STF083010具有改善腎I/R導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)論:1.STF083010可以改善缺血再灌注SD大鼠的腎功能,減輕腎小管上皮細(xì)胞腫脹、間質(zhì)水腫及炎細(xì)胞浸潤減輕;腎小管壞死評分明顯降低。證實(shí)STF083010對腎IRI具有保護(hù)作用。2.大鼠腎IRI時,XBP1s、GRP78、pIRE1水平增加,我們推測I/R激活了ERS,啟動了 UPR。3.STF083010可以使XBP1s/XBP1u mRNA比值降低,pIRE1蛋白表達(dá)降低,推測其通過阻斷IRE1所誘導(dǎo)的XBP1的剪接,從而降低XBP1s的水平,炎癥因子NF-κB、TNF-a、IL-1β的表達(dá)減少,從而發(fā)揮其抗炎效應(yīng)。STF083010對大鼠腎IRI的保護(hù)作用與其抗炎機(jī)制有關(guān)。4.STF083010可能通過阻斷IRE1所誘導(dǎo)的XBP1的剪接,抑制了促凋亡因子CHOP和cleaved Caspase 3相關(guān)的細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。STF083010對大鼠腎IRI的保護(hù)作用與其抗凋亡機(jī)制有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692
【圖文】：

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本文編號：2735080