【摘要】：背景和目的:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)被認(rèn)為是糖尿病進(jìn)展過程中棘手的臨床難題。腎臟微血管異常改變和慢性缺氧與疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。目前DN臨床治療效果不佳,干細(xì)胞治療的興起有望成為DN理想治療措施。本研究旨在通過糖尿病動(dòng)物模型實(shí)施人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)移植治療,觀察糖尿病腎臟缺氧狀態(tài)及相關(guān)因子表達(dá)變化,評(píng)估hAMSCs對(duì)糖尿病腎臟病變的影響。方法:hAMSCs由遵義醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、培養(yǎng)與鑒定,培養(yǎng)P3代細(xì)胞后用于移植干預(yù)治療。1型糖尿病大鼠模型建立是通過單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的。隨機(jī)分選雄性SD大鼠(n=54)共3組,每組18只。其中NC組,PBS腹腔注射代替STZ,另使用PBS靜脈注射代替hAMSCs。DN組,模型建立后不經(jīng)任何措施處理,僅等量PBS陰莖靜脈注射代替hAMSCs。MSC組,成模后于3、4W分別給予第三代hAMSC經(jīng)陰莖靜脈緩慢注射。每組又分3個(gè)時(shí)間點(diǎn),6W、8W、12W。處死動(dòng)物前于代謝籠24h飼養(yǎng)大鼠并收集尿液,水合氯醛麻醉并采血、摘取腎臟標(biāo)本。血液、尿液采集后分別用于檢測(cè)24h尿蛋白、血糖及腎功能。腎臟標(biāo)本包埋及-80℃冰凍冷藏,切片后常規(guī)HE染色及PAS染色觀察腎病理變化,通過檢測(cè)抗人標(biāo)記物抗體(MAB1281)用于觀察移植細(xì)胞腎臟定植,缺氧探針免疫組化檢測(cè)缺氧面積,免疫組化、免疫熒光、Western Bloting和Real Time-PCR檢測(cè)檢測(cè)腎臟缺氧相關(guān)指標(biāo)(HIF-1α、PHD2、HO-1、SDF-1)表達(dá)變化。結(jié)果:(1)DN組和MSC組不同時(shí)間點(diǎn)血糖和24小時(shí)尿蛋白均高于NC組(P0.05);同時(shí)點(diǎn)的MSC組的血糖、24小時(shí)尿蛋白較DN組均不同程度下降,但僅于12W時(shí)的差異有顯著性(P0.05)。(2)DN組與MSC組的血肌酐于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均不同程度高于NC組;MSC組6?12W的血尿素水平均低于DN組(P0.05)。(3)病理組織學(xué)顯示DN組和MSC組的腎重指數(shù)升高,伴有腎小球肥大、系膜基質(zhì)增多、腎小管基底膜有增厚;胰島結(jié)構(gòu)損害,胰島細(xì)胞消失萎縮、壞死并伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn),其中MSC組腎臟、胰腺損傷程度相對(duì)減輕。(4)免疫熒光觀察到MAB1281于各時(shí)點(diǎn)MSCs組的腎臟組織均有分布,而DN及NC組未發(fā)現(xiàn)。(5)缺氧探針免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)NC組在髓內(nèi)與皮質(zhì)交界處有陽性染區(qū),而DN組陽性范圍擴(kuò)大到皮質(zhì)且著色更深,DN組缺氧面積明顯高于MSC組(P0.05)。(6)免疫組化或熒光及蛋白免疫印跡觀察顯示HIF-1ɑ、PHD2、HO-1與SDF-1主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞以及部分腎小球細(xì)胞;DN組與MSC組腎組織各時(shí)點(diǎn)HIF-1ɑ、PHD2、HO-1與SDF-1的表達(dá)較NC組均明顯上調(diào)(P0.05);MSC組在相同時(shí)間點(diǎn)HIF-1、HO-1和SDF-1表達(dá)明顯高于DN組(P0.05),而PHD2的表達(dá)較DN組下調(diào)(P0.05)(7)RT-PCR結(jié)果顯示DN組及MSC組腎組織HIF-1ɑ、PHD2、HO-1與SDF-1mRNA表達(dá)于各時(shí)點(diǎn)均不同程度高于NC組;同時(shí)點(diǎn)的MSC組的HIF-1ɑ、HO-1和SDF-1 mRNA表達(dá)較DN組不同程度上調(diào),并分別于8W和12W、6W和8W、6W和12W時(shí)表達(dá)差異有顯著性(P0.05);MSC組的PHD2的mRNA于各時(shí)點(diǎn)表達(dá)較DN組下調(diào),但只有6W與12W時(shí)差異有顯著性(P0.05)。結(jié)論:慢性缺氧存在于STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟中并參與腎臟病變進(jìn)程,移植hAMSCs可緩解糖尿病大鼠腎臟所存在的缺氧狀態(tài),減輕腎臟病變且這些影響可能與hAMSCs移植改善HIF-PHD缺氧反應(yīng)軸的相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【圖文】：

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 李少斌2 結(jié)果2.1 大鼠表觀情況NC 組大鼠體形勻稱，精力旺盛且飲食狀況良好，動(dòng)作及反應(yīng)靈敏，毛發(fā)平整光滑。DN 組中糖尿病大鼠主要表現(xiàn)為一般情況差，可見萎靡不振，毛質(zhì)粗糙，動(dòng)作及反應(yīng)遲緩，身體弓背攣縮。MSC 組大鼠也具有糖尿病典型癥狀，但精神狀態(tài)較DN 組有所改善（見圖 1）。

Groups 6W 8W 12WNC 7.65±0.25 7.40±0.40 10.57±0.25DN 47.90±4.51*43.39±3.44*35.81±0.89*MSC 42.76±5.99*38.81±3.72*28.64±0.51*△Note: vs group NC, * P＜0.05; vs group DN,△P＜0.05表 6-2 觀察大鼠 24h 尿蛋白變化（ x ±s，n=6，mg/24h ）Table.6-2 The results of 24h urine protein in rats were observed（ x ±s，n=6 ,mg/24h）Groups 6W 8W 12WNC 10.15±3.26 5.24±0.63 6.20±1.23DN 67.60±17.90*32.70±6.35*59.73±7.98*MSC 53.85±14.62*28.47±4.01*33.25±2.49*△Note: vs group NC, * P＜0.05; vs group DN,△P＜0.05

【相似文獻(xiàn)】

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1 李少斌;人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟缺氧相關(guān)因子HIF-PHD軸的影響[D];遵義醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2715056