【摘要】：目的:本實驗擬通過大鼠不同缺血再灌注時間點的損傷性腎勻漿上清液在體外模擬急性腎損傷的微環(huán)境,誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖及分化,探討腎臟缺血再灌注后最適合BMSCs增殖、分化的時間。方法:采用貼壁培養(yǎng)法體外分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs,分為陰性對照組(干細胞培養(yǎng)基);正常腎臟勻漿組(干細胞培養(yǎng)基+10%大鼠正常腎臟勻漿上清液);缺血再灌注12h組(干細胞培養(yǎng)基+10%大鼠缺血再灌注12h腎臟勻漿上清液);缺血再灌注24h組(干細胞培養(yǎng)基+10%大鼠缺血再灌注24h腎臟勻漿上清液);缺血再灌注48h組(干細胞培養(yǎng)基+10%大鼠缺血再灌注48h腎臟勻漿上清液);缺血再灌注72h組(干細胞培養(yǎng)基+10%大鼠缺血再灌注72h腎臟勻漿上清液);缺血再灌注96h組(干細胞培養(yǎng)基+10%大鼠缺血再灌注96h腎臟勻漿上清液)。用CCK8法及細胞板計數(shù)法觀察腎臟勻漿對BMSCs增殖的影響;在第1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d、21d、23d、25d、27d在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變;采用Western Blot以及逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)評估細胞內(nèi)角蛋白18(CK-18)的表達,觀察各組對BMSCs的分化的影響。結(jié)果:1.BMSCs培養(yǎng)至第3代時可見貼壁生長的呈排列密集、旋渦狀、形態(tài)相對均一的長梭形樣細胞群;流式細胞術(shù)鑒定細胞表型CD29,CD90表達陽性,CD34,CD45表達陰性;BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后,能分化為脂肪細胞。2.用細胞板計數(shù)法及CCK8法檢測細胞增殖,各組進行統(tǒng)計分析,缺血再灌注72h腎臟勻漿上清對BMSCs的增殖活性最好。3.通過顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化,正常腎臟勻漿上清液、缺血再灌注12h、24h、48h、96h腎臟勻漿上清液干預(yù)BMSCs,與缺血再灌注72h腎臟勻漿上清液干預(yù)BMSCs相比,缺血再灌注72h組分化的細胞數(shù)量最多;陰性對照組BMSCs形態(tài)為長梭形樣,極少數(shù)細胞形態(tài)發(fā)生變化。4.采用蛋白免疫印跡法及定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)評估檢測誘導(dǎo)后CK-18的表達。其中以缺血再灌注72h的腎臟勻漿上清液誘導(dǎo)細胞CK-18的表達最為明顯;陰性對照組表達CK-18可能與細胞受外界環(huán)境影響發(fā)生變化。結(jié)論:1.缺血再灌注損傷大鼠腎臟勻漿在體外可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向腎小管上皮樣細胞分化。2.腎臟缺血再灌注時間不同,存在不同的損傷微環(huán)境。3.急性損傷修復(fù)過程中可能存在一個有利于干細胞修復(fù)的時間點,本實驗發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注72h進行干細胞治療可能有助于最大程度的發(fā)揮干細胞作用。
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R692.5
【圖文】：

BMSCs形態(tài)圖

流式細胞術(shù)對BMSCs表面抗原鑒定

【參考文獻】

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本文編號：2713208