發(fā)布時(shí)間：2020-06-12 23:45

【摘要】：背景和目的:腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)進(jìn)展至終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的一個(gè)重要原因。既往研究表明,腎小管上皮細(xì)胞在高糖、炎癥狀態(tài)、代謝紊亂及高尿蛋白等因素的刺激下,可出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng),分泌細(xì)胞因子,導(dǎo)致間質(zhì)炎癥和纖維化的發(fā)生,參與了DN的發(fā)生與發(fā)展。但DN具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,因此,進(jìn)一步探討其相關(guān)機(jī)制很有必要。新近研究表明,Slit2/ROBO信號(hào)通路和Gremlin/BMP2信號(hào)通路存在直接負(fù)調(diào)控關(guān)系;已知糖尿病腎病BMP7不足和活性減低是糖尿病腎病進(jìn)展的重要因素之一,我們推測(cè)Slit2\Gremlin\BMP7之間可能存在著某種關(guān)系,最終導(dǎo)致Gremlin細(xì)胞纖維化作用增強(qiáng),而Slit2和BMP7抗纖維化作用減弱,但這些均需要我們?nèi)プC實(shí)。本課題擬通過(guò)研究高糖環(huán)境下,人腎小管上皮細(xì)胞(Human renal proximal tubular cell,HK2)中Slit2/ROBO1、Gremlin/BMP7信號(hào)通路及其相互作用在腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用及其機(jī)制,探討腎小管中兩條抗炎細(xì)胞信號(hào)通路的減弱或活化,為DN TIF提供治療新策略。方法:本實(shí)驗(yàn)分三部分闡述:第一部分:Slit2對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用及其機(jī)制進(jìn)行HK2細(xì)胞的培養(yǎng),設(shè)置高糖刺激濃度10、20mmol/L以及高糖刺激時(shí)間24 h、36h、48h,Western blot法檢測(cè)Slit2、ROBO1、α-SMA和Fibronectin蛋白表達(dá)變化,篩選最佳高糖刺激濃度及時(shí)間,建立Slit2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK2細(xì)胞株,分為正常組、對(duì)照組、高糖組及高糖+空載組、高糖+Slit2組,48 h后,收集各組總蛋白,采用Western blot法檢測(cè)α-SMA和Fibronectin表達(dá)變化。第二部分:Gremlin1對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用及其機(jī)制進(jìn)行HK2細(xì)胞的培養(yǎng),設(shè)置高糖刺激濃度10、20mmol/L以及高糖刺激時(shí)間24 h、36h、48h,Western blot法檢測(cè)Gremlin1和BMP7蛋白表達(dá)變化,篩選最佳高糖刺激濃度及時(shí)間,建立Gremlin1 shRNA慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,分為正常組、對(duì)照組、高糖組及高糖+空載組、高糖+Gremlin1 shRNA組,收集各組總蛋白,采用Western blot法檢測(cè)α-SMA和Fibronectin表達(dá)變化。第三部分:Slit2和Gremlin1相互負(fù)反饋對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用及其機(jī)制將HK2細(xì)胞分為正常組、對(duì)照組、高糖組及高糖+空載組、高糖+Slit2組,經(jīng)最佳高糖刺激時(shí)間及濃度后,收集各組細(xì)胞總蛋白,采用Western blot法檢測(cè)Gremlin1和BMP7、p-smad1/5/9表達(dá)變化;將HK2細(xì)胞分為正常組、對(duì)照組、高糖組及高糖+空載組、高糖+Gremlin1 shRNA組,收集各組細(xì)胞總蛋白,采用Western blot法檢測(cè)Slit2、ROBO1表達(dá)變化。結(jié)果:第一部分:1、在高糖濃度梯度實(shí)驗(yàn)中,與正常組相比,Slit2、ROBO1表達(dá)下降和Fibronectin、α-SMA表達(dá)增加在高糖濃度20mmol/l最明顯;2、在高糖時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)中,與正常組相比,Slit2、ROBO1表達(dá)下降和Fibronectin、α-SMA表達(dá)增加在高糖刺激48h最明顯;3、在高糖環(huán)境下,Slit2過(guò)表達(dá)及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后,與正常組相比,高糖組、高糖+空載組、高糖+Slit2組的Fibronectin表達(dá)增加,α-SMA表達(dá)水平增加;與高糖+空載組相比,高糖+Slit2組的Fibronectin和α-SMA表達(dá)下降。第二部分:1、在高糖濃度梯度實(shí)驗(yàn)中,與正常組相比,Gremlin1表達(dá)升高、BMP7表達(dá)下降在高糖濃度20mmol/l最明顯;2、在高糖時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)中,與正常組相比,BMP7表達(dá)下降、Gremlin1表達(dá)增加在高糖刺激48h最明顯;3、在高糖環(huán)境下,Gremlin1 shRNA及陰性對(duì)照慢病毒感染成功后,與正常組相比,高糖組、高糖+空載組、高糖+Gremlin1 shRNA組的Fibronectin表達(dá)增加,α-SMA表達(dá)水平增加;與高糖+空載組相比,高糖+Gremlin1 shRNA組的Fibronectin和α-SMA表達(dá)下降。第三部分:1、在高糖環(huán)境下,Slit2過(guò)表達(dá)及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后,與正常組相比,高糖組、高糖+空載組、高糖+Slit2組的Gremlin1表達(dá)增加,BMP7、p-smad1/5/9表達(dá)水平下降;與高糖+空載組相比,高糖+Slit2組的Gremlin1表達(dá)水平下降,p-smad1/5/9表達(dá)水平升高。2、在高糖環(huán)境下,Gremlin1 shRNA及陰性對(duì)照慢病毒感染成功后,與正常組相比,高糖組、高糖+空載組、高糖+Gremlin1 shRNA組的Slit2和ROBO1表達(dá)下降增加;與高糖+空載組相比,高糖+Gremlin1 shRNA組的Slit2、ROBO1表達(dá)增加。結(jié)論:1、高糖誘導(dǎo)腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化;高糖處理后,Slit2和ROBO1的表達(dá)下降;過(guò)表達(dá)Slit2可以部分抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。2、高糖促進(jìn)Gremlin1表達(dá),降低BMP7表達(dá);敲降Gremlin1可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。3、Slit2和Gremlin1在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中存在相互調(diào)控。
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文驗(yàn)條件培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度稀釋為 3×104/ml，按每 3 個(gè)復(fù)孔；置于 37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵胞換液處理；養(yǎng)基，使用 DME/F12 培養(yǎng)基清洗 3 次，避免產(chǎn)8 溶液 10μl，再次孵育 1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：Slit2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P，貨號(hào) GOCP3659353，元件順序 Ubi-MCS-3FLAG-CMV-EGFP)及圖 2-1、圖 2-2）。

1.1.5.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（1）質(zhì)粒來(lái)源：Slit2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P，貨號(hào) GOCP3651060028QA，載體稱 GV365，，基因 ID9353，元件順序 Ubi-MCS-3FLAG-CMV-EGFP)及其陰性對(duì)照(上海凱)，-20℃保存（見圖 2-1、圖 2-2）。圖 2-1 Slit2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒片段結(jié)構(gòu)圖
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 彭芳;伍玉婷;劉金穎;秦永潔;;腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與糖尿病腎病[J];北方藥學(xué);2014年02期

2 楊浩;姜濤;宋秀霞;;CRP、IL-6和TNF-α與糖尿病腎病關(guān)系的研究[J];北京醫(yī)學(xué);2011年04期

3 牛敏,常明,劉淑馨;高糖對(duì)體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響[J];遼寧實(shí)用糖尿病雜志;2003年02期

本文編號(hào)：2710283