【摘要】：目的:腎小管間質(zhì)疾病是以腎小管間質(zhì)為主要受累部位的一類疾病,其可表現(xiàn)為急性小管上皮細胞受損,隨后損傷的上皮細胞出現(xiàn)異常損傷后修復,繼而反復的損傷后修復導致腎間質(zhì)細胞活化,進而發(fā)展至腎間質(zhì)纖維化階段。Nrf2-ARE信號通路能夠調(diào)節(jié)機體氧化還原穩(wěn)態(tài),是機體對抗氧化損傷和藥物毒性的最重要防御機制,此外其也參與應激后細胞周期的調(diào)控以及纖維化相關炎癥因子的調(diào)節(jié)。鑒于Nrf2在細胞抗氧化應激、自身細胞保護、損傷后細胞周期調(diào)節(jié)、以及炎癥反應中的起到重要調(diào)節(jié)作用,我們探索Nrf2是否參與腎間質(zhì)疾病發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié),明確其在腎間質(zhì)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用,進而為臨床工作中腎間質(zhì)疾病的治療提供新的思路以及理論依據(jù)。本課題組利用Nrf2基因敲除小鼠,采用經(jīng)典腎間質(zhì)纖維化模型-單側輸尿管結扎模型(UUO),選取造模后的不同的時間點,檢測Nrf2表達情況及其調(diào)節(jié)作用。本課題擬探究Nrf2在腎間質(zhì)疾病不同階段,包括急性損傷,損傷后修復以及慢性纖維化階段,的表達水平變化情況。并探究Nrf2基因缺失是否可以加重急性損傷,干擾損傷后修復以及影響慢性期纖維化發(fā)生等由急性至慢性轉歸病理改變。結締組織生長因子(CTGF)是參與機體組織創(chuàng)傷修復過程的生長因子,其下游可活化Wnt通路,上調(diào)腎小管上皮細胞損傷后異常增殖,以及促進成纖維細胞的活化。我們在腎小管上皮細胞系中探討Nrf2是否通過調(diào)節(jié)CTGF表達進而影響腎間質(zhì)疾病急性至慢性發(fā)展。本研究旨在解析Nrf2在腎間質(zhì)疾病中的作用機制,探索Nrf2是否可以成為腎間質(zhì)疾病的臨床治療新的干預靶點,為Nrf2調(diào)節(jié)劑的臨床應用提供理論依據(jù)。研究方法:1.利用野生型C57/B6小鼠,施行UUO手術,分別在術后2,5,14和21天收取腎臟組織。一部分用于提取蛋白質(zhì)及RNA行分子生物學檢查,后利用Western blot和RT-qPCR技術分析Nrf2-ARE信號通路中Nrf2、Gclc和Ho-1分子的表達,以期明確模型不同階段腎組織中Nrf2以及下游基因的表達情況。另一部分用于病理包埋切片,行PAS病理染色以及Nrf2免疫組化染色,旨在明確Nrf2高表達部位,以及發(fā)現(xiàn)小管損傷部位與Nrf2高表達部位之間的關系,二者是否同一部位。同時行RT-qPCR檢測動態(tài)分析E-cadherin,Vimentin,Fibronectin和α-SMA表達,結合PAS染色為第2部分研究選取合適的研究時間點提供依據(jù)。最后收集急性、亞急性和慢性腎間質(zhì)疾病臨床腎活檢組織病理切片,行PAS和Masson病理染色以及Nrf2免疫組化染色,再次在人病理組織中驗證Nrf2在不同階段腎間質(zhì)疾病中表達情況。2.利用Nrf2基因敲除小鼠,施行單側輸尿管結扎手術,分別在術后2,5,14天收取腎臟組織,分析Nrf2在間質(zhì)疾病急性、亞急性以及慢性階段的作用。在術后2天利用Westernblot技術檢測凋亡指標(C-caspase3和PARP),并利用PAS染色以及TUNEL染色明確病理損傷,后對PAS染色行小管損傷評分以及TUNEL染色定量。在術后5天利用Westernblot技術以及免疫熒光技術檢測細胞增殖指標PCNA以及轉分化指標Vimentin。在術后14天利用Westernblot技術以及免疫染色分析間質(zhì)纖維化指標(Fibronectin和α-SMA)表達。在UUO術后不同時點利用RT-qPCR技術分析Nrf2缺失對抗氧化反應相關基因以及炎癥基因表達的影響。并根據(jù)炎癥相關基因動態(tài)分析,選取14天為時間點,利Westernblot技術以及免疫染色分析巨噬細胞標志物F4/80的表達情況。3.在Nrf2基因敲除小鼠以及Nrf2沉默的腎臟小管上皮細胞系(NRK52E)中,分析小管上皮細胞中Nrf2對CTGF表達情況的調(diào)節(jié)作用。首先在UUO術后5天的腎臟組織中,利用免疫染色、Westernblot以及RT-qPCR方法檢測CTGF表達水平。在NRK52E細胞中應用脂質(zhì)體轉染沉默技術建立Nrf2沉默的細胞模型,給予5%乏氧處理模擬間質(zhì)腎間質(zhì)疾病急性至慢性轉化的重要危險因素,檢測Nrf2基因沉默對CTGF表達水平和Wnt通路活化程度的影響。后在NRK52E細胞中應用脂質(zhì)體轉染沉默技術建立Nrf2以及CTGF雙沉默的細胞模型,在上述乏氧處理條件下,檢測Wnt通路相蛋白p-Lrp6和β-catenine的表達,旨在分析Nrf2沉默對Wnt通路活化是否依賴于CTGF的高表達。最后探索Nrf2對CTGF相關轉錄水平和轉錄后水平的調(diào)控的影響。在Nrf2基因沉默的情況下,檢測CTGF轉錄調(diào)控因子c-fos及其磷酸化形式的表達和轉錄后調(diào)控小RNA(mir26a、mir26b、mir30a以及mir133a)表達水平。結果:1.Westernblot結果顯示UUO術后腎臟組織中Nrf2蛋白表達水平顯著高于對照組。其表達水平在UUO術后第2天開始升高,14天達到峰值,后表達水平下降。UUO組中受Nrf2調(diào)控的Gclc和Ho-1的表達水平也明顯高于對照組織。連續(xù)切片進行PAS染色以及Nrf2免疫染色示Nrf2高表達位于損傷腎小管。與Westernblot結果一致,免疫組化結果示Nrf2在UUO術后第2天開始出現(xiàn)陽性表達,且存在細胞核陽性表達,在UUO術后14天陽性表達區(qū)域最多,以細胞質(zhì)表達為主。E-cadherin,作為急性損傷指標,在UUO術后第2天表達顯著下降。Vimentin,作為小管上皮細胞轉分化指標,在UUO術后第5天開始升高,后持續(xù)高表達。UUO術后第14天,Fibronectin和α-SMA表達水平達到峰值。收集臨床急性、亞急性、慢性腎間質(zhì)病以及癌旁組織標本(作為對照)各3例,其中,男13例,女3例,平均年齡53.56歲,Nrf2免疫組化染色顯示間質(zhì)疾病組織中Nrf2的表達明顯高于對照組織,且在急性間質(zhì)病標本中Nrf2表達水平最高,且有明顯細胞核陽性染色。2.UUO模型術后第2天,Nrf2基因缺失上調(diào)凋亡指標(c-caspase3和c-PARP)表達水平,加重PAS染色小管損傷程度和增加TUNEL染色陽性表達。與野生型小鼠相比,在UUO術后第5天Nrf2基因缺失小鼠的腎臟組織中細胞增殖修復指標PCNA以及轉分化指標Vimentin高表達。在UUO術后第14天,Nrf2基因敲除小鼠腎組織呈現(xiàn)高表達的纖維化標志物Fibronectin和α-SMA以及巨噬細胞標志物F4/80。RT-qPCR結果顯示,抗氧化相關基因Gclc、Ho-1和Nqo1在UUO術后2,5和14天呈高表達水平,但Nrf2基因缺失下調(diào)抗氧化相關基因的高表達。同時在UUO術后5和14天出現(xiàn)炎癥相關促纖維化因子(IL6、IL1β、Tnf和Tgfβ)高表達,Nrf2基因缺失促進炎癥相關促纖維化因子進一步高表達。3.Westernblot以及RT-qPCR結果顯示,在UUO術后第5天,CTGF表達明顯升高,且Nrf2缺失進一步促進CTGF高表達。CTGF免疫染色顯示其高表達部位主要位于腎小管上皮細胞。在NRK52E細胞中Nrf2沉默后給予乏氧處理,Westernblot以及RT-qPCR結果提示上皮細胞轉分化指標高表達,同時CTGF及Wnt通路相關基因(p-Lrp6和β-catenine)高表達。Nrf2與CTGF雙基因沉默后下調(diào)Wnt通路相關基因及轉分化指標Vimentin表達水平。Nrf2沉默可上調(diào)CTGF轉錄調(diào)節(jié)因子cfos及其磷酸化形式的表達水平,但Nrf2對CTGF轉錄后調(diào)節(jié)小RNA(mir-26a、mir-26b、mir-30a和mir-133a)無顯著調(diào)節(jié)作用。結論:1.Nrf2及其下游基因在腎間質(zhì)疾病中處于高表達狀態(tài),并呈現(xiàn)動態(tài)變化,急性期開始升高,存在核表達,隨著腎間質(zhì)疾病慢性化其表達水平逐漸降低;2.Nrf2對間質(zhì)疾病急性損傷,損傷后修復以及間質(zhì)纖維化形成有保護作用;3.在小管間質(zhì)疾病急慢性階段,Nrf2分別通過調(diào)節(jié)氧化應激以及炎癥相關基因發(fā)揮其腎間質(zhì)疾病的保護作用;4.Nrf2可抑制CTGF的轉錄進而下調(diào)Wnt通路的活化水平,從而調(diào)節(jié)腎間質(zhì)疾病急性至慢性轉化。
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3.1 UUO小鼠模型相關基礎數(shù)據(jù)UUO術后腎臟大體標本照片可見隨著術后時間逐漸延長，腎臟皮質(zhì)逐漸變薄，失去原有實質(zhì)臟器形態(tài)。PAS染色可見隨著術后天數(shù)增加腎臟皮質(zhì)逐漸變薄，術后2天示小管上皮細胞刷狀緣脫落，，小管上皮細胞空泡變性以及小管官腔擴張；術后第5天可見部分小管腔的持續(xù)擴張以及部分小管上皮細胞腫脹；術后14天可見間質(zhì)細胞浸潤，小管間質(zhì)擴張和腎臟皮質(zhì)變��；術后21天示腎臟皮質(zhì)進一部變薄，間質(zhì)成分增多和腎臟固有結構改變（圖3.1.1）。腎臟臟器系數(shù)（病側腎臟重量與心臟比值）呈先上升后下降趨勢，術后2天腎臟臟器系數(shù)高于對照組，術后5天開始下降，14-21天腎臟臟器系數(shù)均低于對照組。UUO術后2-21天，E-cadherin,Vimentin, Fibronectin以及α-SMA的mRNA表達水平動態(tài)變化示：E-cadherin在術后2天下降，后持續(xù)呈低表達趨勢；Vimentin表達在術后第5天開始上升后持續(xù)呈現(xiàn)高表達趨勢；Fibronectin和α-SMA在術后14天后持續(xù)呈現(xiàn)高表達趨勢（3.1.2）。

圖 3.1.2 UUO 術后臟器系數(shù)和 E-cadherin, Vimentin 和 Fibronectin 的動態(tài)表達變化A：腎臟臟器系數(shù)（手術腎臟/心臟比值）；B：E-cadherin, Vimentin, Fibronectin 以及 α-SMA 的mRNA 表達水平動態(tài)變化。3.2 Nrf2 及 ARE 下游基因在 UUO 模型腎組織中的表達Westernblot 顯示 Nrf2 及 ARE 下游 Gclc 和 Ho-1 蛋白在 UUO 模型中腎組織中的表達明顯高于假手術組腎組織，且經(jīng)定量分析可見 Nrf2 在 UUO 術后第 5 天開始升高，14 天達到峰值，21 天表達水平回落。而在 UUO 模型組織中，Nrf2 下游基因Gclc 和 Ho-1 在蛋白質(zhì)和基因水平上同樣呈上升趨勢， 但其從術后第 2 天便有明顯增高趨勢，早于 Nrf2 蛋白變化（圖 3.2.1-2）。圖 3.2.3 中圖示如下：高低倍鏡對應的相同位置由⊙符號指示，黑色箭頭指示陽性細胞核表達，紅色箭頭指示陽性細胞漿表達。在 A3-E3 中,“+”指示尚完好小管； “*”指示存在刷狀緣脫落和小管上皮細胞
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R692

【參考文獻】

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1 張金金;胡振林;張俊平;;肝纖維化的細胞和分子機制[J];生命的化學;2011年05期

本文編號：2696746