【摘要】：目的:腎小管間質(zhì)疾病是以腎小管間質(zhì)為主要受累部位的一類(lèi)疾病,其可表現(xiàn)為急性小管上皮細(xì)胞受損,隨后損傷的上皮細(xì)胞出現(xiàn)異常損傷后修復(fù),繼而反復(fù)的損傷后修復(fù)導(dǎo)致腎間質(zhì)細(xì)胞活化,進(jìn)而發(fā)展至腎間質(zhì)纖維化階段。Nrf2-ARE信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài),是機(jī)體對(duì)抗氧化損傷和藥物毒性的最重要防御機(jī)制,此外其也參與應(yīng)激后細(xì)胞周期的調(diào)控以及纖維化相關(guān)炎癥因子的調(diào)節(jié)。鑒于Nrf2在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激、自身細(xì)胞保護(hù)、損傷后細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、以及炎癥反應(yīng)中的起到重要調(diào)節(jié)作用,我們探索Nrf2是否參與腎間質(zhì)疾病發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié),明確其在腎間質(zhì)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用,進(jìn)而為臨床工作中腎間質(zhì)疾病的治療提供新的思路以及理論依據(jù)。本課題組利用Nrf2基因敲除小鼠,采用經(jīng)典腎間質(zhì)纖維化模型-單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型(UUO),選取造模后的不同的時(shí)間點(diǎn),檢測(cè)Nrf2表達(dá)情況及其調(diào)節(jié)作用。本課題擬探究Nrf2在腎間質(zhì)疾病不同階段,包括急性損傷,損傷后修復(fù)以及慢性纖維化階段,的表達(dá)水平變化情況。并探究Nrf2基因缺失是否可以加重急性損傷,干擾損傷后修復(fù)以及影響慢性期纖維化發(fā)生等由急性至慢性轉(zhuǎn)歸病理改變。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是參與機(jī)體組織創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程的生長(zhǎng)因子,其下游可活化Wnt通路,上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞損傷后異常增殖,以及促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化。我們?cè)谀I小管上皮細(xì)胞系中探討Nrf2是否通過(guò)調(diào)節(jié)CTGF表達(dá)進(jìn)而影響腎間質(zhì)疾病急性至慢性發(fā)展。本研究旨在解析Nrf2在腎間質(zhì)疾病中的作用機(jī)制,探索Nrf2是否可以成為腎間質(zhì)疾病的臨床治療新的干預(yù)靶點(diǎn),為Nrf2調(diào)節(jié)劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究方法:1.利用野生型C57/B6小鼠,施行UUO手術(shù),分別在術(shù)后2,5,14和21天收取腎臟組織。一部分用于提取蛋白質(zhì)及RNA行分子生物學(xué)檢查,后利用Western blot和RT-qPCR技術(shù)分析Nrf2-ARE信號(hào)通路中Nrf2、Gclc和Ho-1分子的表達(dá),以期明確模型不同階段腎組織中Nrf2以及下游基因的表達(dá)情況。另一部分用于病理包埋切片,行PAS病理染色以及Nrf2免疫組化染色,旨在明確Nrf2高表達(dá)部位,以及發(fā)現(xiàn)小管損傷部位與Nrf2高表達(dá)部位之間的關(guān)系,二者是否同一部位。同時(shí)行RT-qPCR檢測(cè)動(dòng)態(tài)分析E-cadherin,Vimentin,Fibronectin和α-SMA表達(dá),結(jié)合PAS染色為第2部分研究選取合適的研究時(shí)間點(diǎn)提供依據(jù)。最后收集急性、亞急性和慢性腎間質(zhì)疾病臨床腎活檢組織病理切片,行PAS和Masson病理染色以及Nrf2免疫組化染色,再次在人病理組織中驗(yàn)證Nrf2在不同階段腎間質(zhì)疾病中表達(dá)情況。2.利用Nrf2基因敲除小鼠,施行單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù),分別在術(shù)后2,5,14天收取腎臟組織,分析Nrf2在間質(zhì)疾病急性、亞急性以及慢性階段的作用。在術(shù)后2天利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)凋亡指標(biāo)(C-caspase3和PARP),并利用PAS染色以及TUNEL染色明確病理?yè)p傷,后對(duì)PAS染色行小管損傷評(píng)分以及TUNEL染色定量。在術(shù)后5天利用Westernblot技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖指標(biāo)PCNA以及轉(zhuǎn)分化指標(biāo)Vimentin。在術(shù)后14天利用Westernblot技術(shù)以及免疫染色分析間質(zhì)纖維化指標(biāo)(Fibronectin和α-SMA)表達(dá)。在UUO術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)利用RT-qPCR技術(shù)分析Nrf2缺失對(duì)抗氧化反應(yīng)相關(guān)基因以及炎癥基因表達(dá)的影響。并根據(jù)炎癥相關(guān)基因動(dòng)態(tài)分析,選取14天為時(shí)間點(diǎn),利Westernblot技術(shù)以及免疫染色分析巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的表達(dá)情況。3.在Nrf2基因敲除小鼠以及Nrf2沉默的腎臟小管上皮細(xì)胞系(NRK52E)中,分析小管上皮細(xì)胞中Nrf2對(duì)CTGF表達(dá)情況的調(diào)節(jié)作用。首先在UUO術(shù)后5天的腎臟組織中,利用免疫染色、Westernblot以及RT-qPCR方法檢測(cè)CTGF表達(dá)水平。在NRK52E細(xì)胞中應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染沉默技術(shù)建立Nrf2沉默的細(xì)胞模型,給予5%乏氧處理模擬間質(zhì)腎間質(zhì)疾病急性至慢性轉(zhuǎn)化的重要危險(xiǎn)因素,檢測(cè)Nrf2基因沉默對(duì)CTGF表達(dá)水平和Wnt通路活化程度的影響。后在NRK52E細(xì)胞中應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染沉默技術(shù)建立Nrf2以及CTGF雙沉默的細(xì)胞模型,在上述乏氧處理?xiàng)l件下,檢測(cè)Wnt通路相蛋白p-Lrp6和β-catenine的表達(dá),旨在分析Nrf2沉默對(duì)Wnt通路活化是否依賴(lài)于CTGF的高表達(dá)。最后探索Nrf2對(duì)CTGF相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控的影響。在Nrf2基因沉默的情況下,檢測(cè)CTGF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子c-fos及其磷酸化形式的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控小RNA(mir26a、mir26b、mir30a以及mir133a)表達(dá)水平。結(jié)果:1.Westernblot結(jié)果顯示UUO術(shù)后腎臟組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。其表達(dá)水平在UUO術(shù)后第2天開(kāi)始升高,14天達(dá)到峰值,后表達(dá)水平下降。UUO組中受Nrf2調(diào)控的Gclc和Ho-1的表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組織。連續(xù)切片進(jìn)行PAS染色以及Nrf2免疫染色示Nrf2高表達(dá)位于損傷腎小管。與Westernblot結(jié)果一致,免疫組化結(jié)果示Nrf2在UUO術(shù)后第2天開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá),且存在細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá),在UUO術(shù)后14天陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域最多,以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主。E-cadherin,作為急性損傷指標(biāo),在UUO術(shù)后第2天表達(dá)顯著下降。Vimentin,作為小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化指標(biāo),在UUO術(shù)后第5天開(kāi)始升高,后持續(xù)高表達(dá)。UUO術(shù)后第14天,Fibronectin和α-SMA表達(dá)水平達(dá)到峰值。收集臨床急性、亞急性、慢性腎間質(zhì)病以及癌旁組織標(biāo)本(作為對(duì)照)各3例,其中,男13例,女3例,平均年齡53.56歲,Nrf2免疫組化染色顯示間質(zhì)疾病組織中Nrf2的表達(dá)明顯高于對(duì)照組織,且在急性間質(zhì)病標(biāo)本中Nrf2表達(dá)水平最高,且有明顯細(xì)胞核陽(yáng)性染色。2.UUO模型術(shù)后第2天,Nrf2基因缺失上調(diào)凋亡指標(biāo)(c-caspase3和c-PARP)表達(dá)水平,加重PAS染色小管損傷程度和增加TUNEL染色陽(yáng)性表達(dá)。與野生型小鼠相比,在UUO術(shù)后第5天Nrf2基因缺失小鼠的腎臟組織中細(xì)胞增殖修復(fù)指標(biāo)PCNA以及轉(zhuǎn)分化指標(biāo)Vimentin高表達(dá)。在UUO術(shù)后第14天,Nrf2基因敲除小鼠腎組織呈現(xiàn)高表達(dá)的纖維化標(biāo)志物Fibronectin和α-SMA以及巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80。RT-qPCR結(jié)果顯示,抗氧化相關(guān)基因Gclc、Ho-1和Nqo1在UUO術(shù)后2,5和14天呈高表達(dá)水平,但Nrf2基因缺失下調(diào)抗氧化相關(guān)基因的高表達(dá)。同時(shí)在UUO術(shù)后5和14天出現(xiàn)炎癥相關(guān)促纖維化因子(IL6、IL1β、Tnf和Tgfβ)高表達(dá),Nrf2基因缺失促進(jìn)炎癥相關(guān)促纖維化因子進(jìn)一步高表達(dá)。3.Westernblot以及RT-qPCR結(jié)果顯示,在UUO術(shù)后第5天,CTGF表達(dá)明顯升高,且Nrf2缺失進(jìn)一步促進(jìn)CTGF高表達(dá)。CTGF免疫染色顯示其高表達(dá)部位主要位于腎小管上皮細(xì)胞。在NRK52E細(xì)胞中Nrf2沉默后給予乏氧處理,Westernblot以及RT-qPCR結(jié)果提示上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化指標(biāo)高表達(dá),同時(shí)CTGF及Wnt通路相關(guān)基因(p-Lrp6和β-catenine)高表達(dá)。Nrf2與CTGF雙基因沉默后下調(diào)Wnt通路相關(guān)基因及轉(zhuǎn)分化指標(biāo)Vimentin表達(dá)水平。Nrf2沉默可上調(diào)CTGF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子cfos及其磷酸化形式的表達(dá)水平,但Nrf2對(duì)CTGF轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)小RNA(mir-26a、mir-26b、mir-30a和mir-133a)無(wú)顯著調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:1.Nrf2及其下游基因在腎間質(zhì)疾病中處于高表達(dá)狀態(tài),并呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,急性期開(kāi)始升高,存在核表達(dá),隨著腎間質(zhì)疾病慢性化其表達(dá)水平逐漸降低;2.Nrf2對(duì)間質(zhì)疾病急性損傷,損傷后修復(fù)以及間質(zhì)纖維化形成有保護(hù)作用;3.在小管間質(zhì)疾病急慢性階段,Nrf2分別通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激以及炎癥相關(guān)基因發(fā)揮其腎間質(zhì)疾病的保護(hù)作用;4.Nrf2可抑制CTGF的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而下調(diào)Wnt通路的活化水平,從而調(diào)節(jié)腎間質(zhì)疾病急性至慢性轉(zhuǎn)化。
【圖文】：

3.1 UUO小鼠模型相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)UUO術(shù)后腎臟大體標(biāo)本照片可見(jiàn)隨著術(shù)后時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，腎臟皮質(zhì)逐漸變薄，失去原有實(shí)質(zhì)臟器形態(tài)。PAS染色可見(jiàn)隨著術(shù)后天數(shù)增加腎臟皮質(zhì)逐漸變薄，術(shù)后2天示小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落，，小管上皮細(xì)胞空泡變性以及小管官腔擴(kuò)張；術(shù)后第5天可見(jiàn)部分小管腔的持續(xù)擴(kuò)張以及部分小管上皮細(xì)胞腫脹；術(shù)后14天可見(jiàn)間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，小管間質(zhì)擴(kuò)張和腎臟皮質(zhì)變薄；術(shù)后21天示腎臟皮質(zhì)進(jìn)一部變薄，間質(zhì)成分增多和腎臟固有結(jié)構(gòu)改變（圖3.1.1）。腎臟臟器系數(shù)（病側(cè)腎臟重量與心臟比值）呈先上升后下降趨勢(shì)，術(shù)后2天腎臟臟器系數(shù)高于對(duì)照組，術(shù)后5天開(kāi)始下降，14-21天腎臟臟器系數(shù)均低于對(duì)照組。UUO術(shù)后2-21天，E-cadherin,Vimentin, Fibronectin以及α-SMA的mRNA表達(dá)水平動(dòng)態(tài)變化示：E-cadherin在術(shù)后2天下降，后持續(xù)呈低表達(dá)趨勢(shì)；Vimentin表達(dá)在術(shù)后第5天開(kāi)始上升后持續(xù)呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)；Fibronectin和α-SMA在術(shù)后14天后持續(xù)呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)（3.1.2）。

圖 3.1.2 UUO 術(shù)后臟器系數(shù)和 E-cadherin, Vimentin 和 Fibronectin 的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化A：腎臟臟器系數(shù)（手術(shù)腎臟/心臟比值）；B：E-cadherin, Vimentin, Fibronectin 以及 α-SMA 的mRNA 表達(dá)水平動(dòng)態(tài)變化。3.2 Nrf2 及 ARE 下游基因在 UUO 模型腎組織中的表達(dá)Westernblot 顯示 Nrf2 及 ARE 下游 Gclc 和 Ho-1 蛋白在 UUO 模型中腎組織中的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組腎組織，且經(jīng)定量分析可見(jiàn) Nrf2 在 UUO 術(shù)后第 5 天開(kāi)始升高，14 天達(dá)到峰值，21 天表達(dá)水平回落。而在 UUO 模型組織中，Nrf2 下游基因Gclc 和 Ho-1 在蛋白質(zhì)和基因水平上同樣呈上升趨勢(shì)， 但其從術(shù)后第 2 天便有明顯增高趨勢(shì)，早于 Nrf2 蛋白變化（圖 3.2.1-2）。圖 3.2.3 中圖示如下：高低倍鏡對(duì)應(yīng)的相同位置由⊙符號(hào)指示，黑色箭頭指示陽(yáng)性細(xì)胞核表達(dá)，紅色箭頭指示陽(yáng)性細(xì)胞漿表達(dá)。在 A3-E3 中,“+”指示尚完好小管； “*”指示存在刷狀緣脫落和小管上皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張金金;胡振林;張俊平;;肝纖維化的細(xì)胞和分子機(jī)制[J];生命的化學(xué);2011年05期

本文編號(hào)：2696746