【摘要】：目的:為了探索膀胱癌特異性治療方法,本研究采用合成生物學的原理,設計、構建合成調控元件,特異性地識別和殺傷膀胱癌細胞。方法:構建由人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)啟動子驅動的酵母轉錄激活蛋白GAL4載體、由上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)驅動的CRISPR/Cas9系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated system)載體并在細胞內(nèi)共轉染表達。采用雙熒光素酶報告實驗驗證hTERT啟動子在人成纖維細胞HFF、膀胱癌細胞5637和T24中對下游基因的激活轉錄活性及GAL4/UAS二元表達系統(tǒng)在各細胞系中的調控作用;采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測HRAS基因在對照組細胞和實驗組細胞中的表達量變化;采用Sanger測序法檢測對照組細胞與實驗組細胞中HRAS基因靶序列是否被剪切;采用CCK-8法、流式細胞術、細胞劃痕實驗和Transwell實驗,檢測合成調控系統(tǒng)對于膀胱癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。結果:雙熒光素酶實驗結果顯示,hTERT啟動子在膀胱癌細胞T24和5637細胞中對下游基因有轉錄激活能力,而在人成纖維細胞HFF細胞中對下游基因無轉錄激活能力;在T24和5637細胞中,融合蛋白GAL4-P65對上游激活序列UAS的激活效果顯著性地高于GAL4-VP64。qPCR結果顯示,靶向HRAS基因的調控元件顯著性地降低了HRAS在T24和5637中的表達。Sanger測序結果顯示,在T24和5637細胞中,調控元件對HRAS基因進行了基因剪切。CCK-8法、流式細胞術、細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示,人工合成調控元件對HFF細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲無明顯影響,但明顯地抑制了膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進了細胞凋亡。結論:由增強型hTERT啟動子、GAL4/UAS系統(tǒng)和CRISPR-Cas9工具組成的調控系統(tǒng)可以特異性地剪切膀胱癌細胞T24和5637中的HRAS基因,抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進細胞凋亡;對正常細胞無明顯影響。
【圖文】：

圖 3.1 在 HFF、T24 及 5637 細胞中不同種類質粒的熒光表達水平。經(jīng)雙熒光素酶報告實驗檢測 HFF (A), T24 (B) and 5637 (C) 細胞中的熒光強度。在這三個細胞系中，CMV-GAL4-P65 組激活熒光的能力要高于 CMV-GAL4-VP64 組。然而，在 T24細胞系和 5637 細胞系中，hTERT-GAL4-p65 組熒光表達要明顯強于對照組，，在 HFF細胞系中沒有差別。數(shù)據(jù)以平均±標準差(SD)表示。每個實驗被重復三次，每次設有三個重復組。每個誤差條表示三個獨立實驗的平均值之間的變化。Fig. 3.1 Luciferase expression levels of several different kinds of vectors in HFF, T24and 5637 cells. The luciferase activities in HFF (A), T24 (B) and 5637 (C) cells weremeasured by the dual luciferase reporter assay. The luciferase activities in theCMV-GAL4-P65 group were significantly higher than those in the CMV-GAL4-VP64group in these three cell lines. However, while the activities in the hTERT-GAL4-p65

采用實時熒光定量 PCR 檢測經(jīng)慢病毒轉染后的細胞系 T24 和 5637 及人成纖維細胞 HFF 的 HRAS 表達量，如圖所示，與人成纖維細胞系 HFF 相比，轉染人工合成載體后，HRAS 基因在 T24 和 5637 細胞中都有明顯的下調，差異具有統(tǒng)計學意義。而在 HFF 細胞系中，則無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義。(*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001)
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 黃明文;邵江華;;人端粒酶逆轉錄酶基因啟動子在腫瘤靶向性基因治療中的作用[J];實用臨床醫(yī)學;2007年09期

2 艾迪;李文杰;李一權;陳爽;朱羿龍;崔英麗;李敏;崔傳信;尹遜哲;李善智;馬藝珍;李霄;金寧一;;攜帶Apoptin及hTERT啟動子的雙重特異性重組腺病毒的構建及鑒定[J];中國獸醫(yī)學報;2018年05期

3 周聯(lián)明;張學利;單遠洲;張吉發(fā);朱光輝;;hTERT啟動子驅動TRAIL基因表達載體對結腸癌HT-29細胞的抑制作用研究[J];結直腸肛門外科;2018年03期

4 李寶玉;陳劍秋;;hTERT啟動子調控PE38KDEL基因載體的構建及其鑒定[J];中國臨床研究;2010年12期

5 邢帥;孫晉津;李寶玉;孫寧;陳劍秋;;靶向phTERT-PE38KDEL重組質粒聯(lián)合硼替佐米抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生長的研究[J];實用醫(yī)學雜志;2011年19期

6 郭玉忠,史惠蓉,姜國忠,李克虹,王建民,薛樂勛;拓撲替康和更昔洛韋單獨或聯(lián)合應用對SKOV3/tk細胞生長的影響[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2004年04期

7 劉燕;鄧志華;楊長青;劉京龍;賈靜;郭素雅;楊強;;重組腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV系統(tǒng)的構建及其對人肝癌細胞HepG2的殺傷作用及旁觀者效應研究[J];中國癌癥雜志;2009年01期

8 馬蘭芳;李慧;何敬堂;劉小麗;劉江奎;楊長青;;自殺基因協(xié)同表達促肝癌細胞凋亡的研究[J];中國腫瘤臨床;2009年22期

9 王娟;顧錦法;楊水云;肖田;齊榮;孫蘭英;劉新垣;;癌特異性雙靶向載體的安全性及其攜帶基因的殺傷性[J];癌癥;2006年04期

10 王麗娜;薛志剛;李卓;薛金鋒;劉雄昊;潘乾;龍志高;蔡芳;鄔玲阡;戴和平;夏昆;梁德生;夏家輝;;特異性核糖體基因區(qū)打靶載體介導CDUPRT治療肝癌的體內(nèi)外研究[J];科學通報;2006年18期

相關博士學位論文 前7條

1 郭玉忠;hTERT啟動子調控的HSV-tk基因治療系統(tǒng)對卵巢癌細胞的作用[D];鄭州大學;2004年

2 張勇;攜帶hTERT啟動子的腺病毒介導的HSV-tk/GCV系統(tǒng)治療前列腺癌的實驗研究[D];河北醫(yī)科大學;2005年

3 朱曉應;hTERT啟動子調控p53基因表達對T24細胞凋亡的作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2006年

4 黃淑華;hTERT啟動子調控腺病毒介導的CD基因治療卵巢癌的實驗研究[D];四川大學;2006年

5 王毅剛;攜帶TRAIL基因的腫瘤靶向性腺相關病毒載體構建及其對肝癌的抑制效應[D];華東理工大學;2010年

6 余松濤;hTERT啟動子靶向性活體光學實時成像技術在腫瘤診斷及療效評估中作用的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2010年

7 李瑋;GFAP及hTERT雙啟動子靶向性表達hNIS基因引導放射性碘治療膠質瘤[D];天津醫(yī)科大學;2013年

相關碩士學位論文 前10條

1 黃新波;hTERT啟動子調控元件的構建及其在膀胱癌靶向治療中的應用[D];安徽醫(yī)科大學;2018年

2 馮京;利用腫瘤特異性和可熱調控的siRNA表達載體條件性敲除基因[D];重慶大學;2015年

3 李倩倩;phTERT-tumstatin載體構建及其抗血管形成[D];山西醫(yī)科大學;2011年

4 王文博;靶向性誘導腫瘤細胞凋亡聯(lián)合抑制血管生成治療人乳腺癌的實驗研究[D];山東大學;2006年

5 賈靜;殼聚糖納米粒介導的hTERTp-TK/GCV靶向抗肝癌研究[D];山西醫(yī)科大學;2009年

6 滑瑋;修飾hTERT核心啟動子靶向轉錄FCY_1的重組腺病毒的構建及鑒定[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;2003年

7 李文靜;攜帶Apoptin與IL-24的溶瘤腺病毒的構建及其腫瘤細胞殺傷研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2014年

8 李金華;hTERT啟動子調控的TRAIL基因對肝癌細胞作用的實驗研究[D];吉林大學;2010年

9 吳蓓;hTERT啟動子的克隆及其啟動效率的研究[D];天津醫(yī)科大學;2011年

10 李寶玉;hTERT啟動子調控PE38KDEL基因載體的構建及其在MiaPaCa2細胞中的表達[D];天津醫(yī)科大學;2009年

本文編號：2688733