骨髓源性生長因子（MYDGF）在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用

發(fā)布時(shí)間：2020-05-09 05:17

【摘要】：研究背景糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的重要原因。但是,糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,更為重要的是目前臨床上缺乏治療糖尿病腎病有效藥物。因此,尋找新型潛在的治療靶點(diǎn),對于糖尿病腎病的臨床治療具有重要意義。足細(xì)胞(podocyte),即腎小囊臟層上皮細(xì)胞,是構(gòu)成腎小球血液濾過屏障重要成分,在維持腎小球的正常功能方面發(fā)揮了重要作用。足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,主要表現(xiàn)為足細(xì)胞數(shù)量和密度減少、足細(xì)胞肥大變性以及足突融合和消失。所以改善足細(xì)胞損傷和尋找有效的治療靶點(diǎn)對于糖尿病腎病的治療具有非常重要的意義。骨髓源性生長因子(Myeloid-derived growth factor,MYDGF)是一種新型的分泌型生長因子,最近的研究表明MYDGF在急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)的發(fā)病過程中具有重要的保護(hù)作用。但是,MYDGF在腎臟的表達(dá)功能,特別是在糖尿病腎病中發(fā)生發(fā)展中的作用,迄今未見報(bào)道。因此,探究MYDGF在糖尿病腎病中的作用,對于闡明糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制,尋找有效的臨床治療靶點(diǎn)具有重要意義。研究目的1.表征MYDGF在糖尿病腎病中的表達(dá)變化,明確MYDGF是否是通過影響足細(xì)胞來參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。2.初步探討MYDGF在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的功能和機(jī)制。研究方法第一部分:MYDGF在糖尿病腎病中的表達(dá)變化1.利用RT-PCR和Real-time RT-PCR方法檢測在雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠主要臟器和不同腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中MYDGF的表達(dá)情況首先取出WT小鼠各器官,通過RT-PCR和Real-time RT-PCR方法檢測MYDGF在小鼠各臟器中的mRNA含量。體外培養(yǎng)人腎小球足細(xì)胞(human podocyte,HPC)、小鼠腎小球足細(xì)胞(mouse podocyte,MPC)、人腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cell,HK-2)、大鼠系膜細(xì)胞(rat messangial cell,RMC)和大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cell,GENC),通過RT-PCR和Real-time RT-PCR方法檢測MYDGF在各種腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)變化。2.驗(yàn)證鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠模型的建立選取10周齡左右的雄性野生型C57BL/6J小鼠,單腎摘除后培養(yǎng)一周,腹腔注射STZ,劑量為100mg/kg,連續(xù)注射三天誘導(dǎo)糖尿病腎病。使用血糖儀檢測小鼠末梢靜脈全血中葡萄糖濃度(glucose,GLU),測量腎重、計(jì)算腎重比(Relative kidney weight,RKW)以及通過ELISA試劑盒檢測糖尿病小鼠尿白蛋白和肌酐(urinary albumin:creatinine ratio,UACR),同時(shí)用過碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain,PAS)和免疫熒光(Immunofluorescence,IF)的方法檢測糖原沉積和Nephrin、Podocin的表達(dá)量。通過以上指標(biāo)和方法來驗(yàn)證糖尿病腎病模型造模成功。3.db/db小鼠相關(guān)生理指標(biāo)的表征我們購買了一批db/db 16周小鼠。使用血糖儀檢測小鼠GLU,測量腎重、計(jì)算RKW以及通過ELISA試劑盒檢測糖尿病小鼠UACR,同時(shí)用PAS染色和免疫熒光的方法檢測糖原沉積和Nephrin、Podocin的表達(dá)量。通過以上指標(biāo)和方法來驗(yàn)證糖尿病腎病模型造模成功。4.檢測在糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)中MYDGF的表達(dá)情況當(dāng)小鼠模型構(gòu)建成功后,通過Real-time RT-PCR和蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)的方法檢測MYDGF在糖尿病腎病小鼠腎臟中的表達(dá)變化。5.糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)刺激不同腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞后檢測MYDGF的表達(dá)水平變化體外培養(yǎng)HPC、MPC、HK-2、RMC和GENC,分別給予AGE刺激48小時(shí)后抽提細(xì)胞內(nèi)蛋白,進(jìn)行免疫印跡分析,檢測在AGE刺激下MYDGF在不同腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)變化。6.體外AGE刺激下檢測在不同腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞上清液中MYDGF的表達(dá)變化體外培養(yǎng)HPC、MPC、HK-2、RMC、GENC和分別給予AGE刺激48小時(shí)后取細(xì)胞上清液,通過ELISA方法檢測在不同腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MYDGF的表達(dá)變化。7.利用免疫熒光方法檢測MYDGF在糖尿病腎病小鼠腎臟的表達(dá)分布及變化選取10周齡左右的雄性野生型C57BL/6J小鼠,單腎摘除恢復(fù)一周后,腹腔注射STZ,劑量為100mg/kg,連續(xù)注射三天誘導(dǎo)糖尿病腎病。當(dāng)小鼠糖尿病腎病模型構(gòu)建成功后,利用免疫熒光雙染方法檢測糖尿病腎病小鼠腎小球中MYDGF的表達(dá)變化。第二部分:MYDGF在糖尿病腎病中的作用及機(jī)制初步探討1.流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)MYDGF對AGE誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響體外培養(yǎng)HPC細(xì)胞,轉(zhuǎn)染MYDGF過表達(dá)質(zhì)粒后,給予AGE刺激48小時(shí)后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測足細(xì)胞凋亡的水平。2.利用蛋白印跡方法檢測過表達(dá)MYDGF對AGE誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的影響。體外培養(yǎng)HPC細(xì)胞,轉(zhuǎn)染MYDGF過表達(dá)質(zhì)粒后,給予AGE刺激48小時(shí),WB方法檢測足細(xì)胞功能蛋白Podocin、WT1和Nephrin的表達(dá)水平。3.利用蛋白免疫印跡法檢測過表達(dá)MYDGF對足細(xì)胞高糖條件下自噬水平的影響。體外培養(yǎng)HPC細(xì)胞,轉(zhuǎn)染MYDGF過表達(dá)質(zhì)粒后,給予AGE刺激48小時(shí)后,WB方法檢測自噬相關(guān)蛋白ATG12、LC3 Ⅱ、P62、beclin-1、ATG5和VPS34的表達(dá)水平。4.利用基因芯片技術(shù)分析差異基因通過基因芯片技術(shù)分析AGE誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷組和MYDGF過表達(dá)組間的差異表達(dá)基因,并繪制Wnt家族分子熱圖。研究結(jié)果第一部分:MYDGF在糖尿病腎病中的表達(dá)變化1.在WT小鼠主要臟器中,肝臟和腎臟的MYDGF表達(dá)量相對較高;在不同腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中RMC和GENC的MYDGF表達(dá)量相對較高首先對MYDGF在小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器中的表達(dá)情況進(jìn)行了表征,RT-PCR和Real-time RT-PCR結(jié)果顯示MYDGFmRNA水平在腎臟和肝臟中的表達(dá)量相對較高,在心、脾、肺、腦中的表達(dá)量相對較低。MYDGF在RMC和GENC的表達(dá)量相對較高。2.STZ誘導(dǎo)的一型糖尿病腎病模型造模成功GLU、RKW和UACR結(jié)果顯示:與對照組小鼠相比,STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠的GLU、RKW、UACR都明顯升高。PAS染色結(jié)果也顯示與對照組小鼠相比,STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠糖原沉積與系膜增生明顯增加。IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示與對照組小鼠相比,STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠Nephrin和Podocin的表達(dá)量都明顯降低。3.db/db小鼠模型符合二型糖尿病腎病模型GLU、RKW和UACR的結(jié)果顯示:與對照組小鼠相比,db/db小鼠GLU、RKW、UACR都明顯升高。PAS染色結(jié)果也顯示與對照組小鼠相比,db/db小鼠糖原沉積與系膜增生明顯增加。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示與對照組小鼠相比,db/db小鼠Nephrin和Podocin的表達(dá)量都明顯降低。4.MYDGF在糖尿病腎病小鼠腎臟中的表達(dá)水平明顯下降WB和Real-time RT-PCR結(jié)果表明,MYDGF在STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型組和db/db小鼠腎臟組織中與對照組相比表達(dá)顯著下降。5.AGE刺激能夠顯著下調(diào)足細(xì)胞中MYDGF蛋白水平蛋白免疫印跡結(jié)果表明,AGE可以顯著誘導(dǎo)HPC和MPC中的MYDGF的表達(dá)水平明顯下調(diào)。HK-2中MYDGF蛋白表達(dá)也有所下降,但GENC和RMC中MYDGF蛋白表達(dá)沒有明顯的變化,表明MYDGF在高糖條件下具有相對細(xì)胞特異性的變化。6.AGE刺激顯著下調(diào)人腎小球足細(xì)胞和小鼠腎小球足細(xì)胞上清液中MYDGF蛋白水平ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在HPC和MPC的細(xì)胞上清液中MYDGF的表達(dá)均下降。在HK-2的細(xì)胞上清液中MYDGF蛋白也有所下降。在RMC和GENC細(xì)胞上清液中MYDGF的表達(dá)沒有明顯變化。7.MYDGF在糖尿病腎病小鼠腎小球足細(xì)胞中表達(dá)水平明顯下調(diào)。雖然免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MYDGF在腎小球足細(xì)胞和腎小管中均有表達(dá),但與對照組相比,由STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠,MYDGF在足細(xì)胞內(nèi)下降更加顯著。第二部分:MYDGF在糖尿病腎病中的作用及機(jī)制初步探討1.MYDGF的過表達(dá)明顯減輕AGE誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,AGE可以明顯加重足細(xì)胞的凋亡,而過表達(dá)MYDGF可以明顯改善足細(xì)胞的凋亡。2.MYDGF的過表達(dá)改善AGE誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。Western blot結(jié)果顯示,AGE可以明顯下調(diào)Podocin和WT1的表達(dá),而過表MYDGF可明顯逆轉(zhuǎn)Podocin和WT1的下調(diào)。3.MYDGF的過表達(dá)上調(diào)足細(xì)胞自噬水平。Western blot結(jié)果顯示,AGE可以明顯下調(diào)ATG12和LC3 Ⅱ的表達(dá),而過表MYDGF可明顯恢復(fù)ATG12和LC3 Ⅱ的表達(dá)。AGE可以明顯上調(diào)P62的表達(dá),而過表MYDGF可明顯降低P62的表達(dá)。4.利用基因芯片技術(shù)分析差異基因通過基因芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Wnt家族部分成員在AGE誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷組中表達(dá)明顯降低,Wntl降低最明顯。MYDGF的過表達(dá)可明顯恢復(fù)損傷所誘導(dǎo)的這些基因的表達(dá)變化。結(jié)論與創(chuàng)新性:1.糖尿病腎病小鼠模型中MYDGF顯著降低,并且在AGE刺激下足細(xì)胞內(nèi)的MYDGF蛋白水平與上清中MYDGF 水平都明顯下調(diào),提示MYDGF與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),且可能參與足細(xì)胞的損傷。2.MYDGF可能通過調(diào)節(jié)自噬水平和足細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步發(fā)揮對足細(xì)胞及腎臟的保護(hù)作用。
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