骨髓源性生長因子（MYDGF）在糖尿病腎病足細胞損傷中的保護作用

發(fā)布時間：2020-05-09 05:17

【摘要】：研究背景糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥,也是導致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的重要原因。但是,糖尿病腎病的發(fā)病機制尚不完全清楚,更為重要的是目前臨床上缺乏治療糖尿病腎病有效藥物。因此,尋找新型潛在的治療靶點,對于糖尿病腎病的臨床治療具有重要意義。足細胞(podocyte),即腎小囊臟層上皮細胞,是構(gòu)成腎小球血液濾過屏障重要成分,在維持腎小球的正常功能方面發(fā)揮了重要作用。足細胞損傷在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,主要表現(xiàn)為足細胞數(shù)量和密度減少、足細胞肥大變性以及足突融合和消失。所以改善足細胞損傷和尋找有效的治療靶點對于糖尿病腎病的治療具有非常重要的意義。骨髓源性生長因子(Myeloid-derived growth factor,MYDGF)是一種新型的分泌型生長因子,最近的研究表明MYDGF在急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)的發(fā)病過程中具有重要的保護作用。但是,MYDGF在腎臟的表達功能,特別是在糖尿病腎病中發(fā)生發(fā)展中的作用,迄今未見報道。因此,探究MYDGF在糖尿病腎病中的作用,對于闡明糖尿病腎病發(fā)病機制,尋找有效的臨床治療靶點具有重要意義。研究目的1.表征MYDGF在糖尿病腎病中的表達變化,明確MYDGF是否是通過影響足細胞來參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。2.初步探討MYDGF在糖尿病腎病足細胞損傷中的功能和機制。研究方法第一部分:MYDGF在糖尿病腎病中的表達變化1.利用RT-PCR和Real-time RT-PCR方法檢測在雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠主要臟器和不同腎臟實質(zhì)細胞中MYDGF的表達情況首先取出WT小鼠各器官,通過RT-PCR和Real-time RT-PCR方法檢測MYDGF在小鼠各臟器中的mRNA含量。體外培養(yǎng)人腎小球足細胞(human podocyte,HPC)、小鼠腎小球足細胞(mouse podocyte,MPC)、人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cell,HK-2)、大鼠系膜細胞(rat messangial cell,RMC)和大鼠腎小球內(nèi)皮細胞(glomerular endothelial cell,GENC),通過RT-PCR和Real-time RT-PCR方法檢測MYDGF在各種腎臟實質(zhì)細胞中的表達變化。2.驗證鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病腎病小鼠模型的建立選取10周齡左右的雄性野生型C57BL/6J小鼠,單腎摘除后培養(yǎng)一周,腹腔注射STZ,劑量為100mg/kg,連續(xù)注射三天誘導糖尿病腎病。使用血糖儀檢測小鼠末梢靜脈全血中葡萄糖濃度(glucose,GLU),測量腎重、計算腎重比(Relative kidney weight,RKW)以及通過ELISA試劑盒檢測糖尿病小鼠尿白蛋白和肌酐(urinary albumin:creatinine ratio,UACR),同時用過碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain,PAS)和免疫熒光(Immunofluorescence,IF)的方法檢測糖原沉積和Nephrin、Podocin的表達量。通過以上指標和方法來驗證糖尿病腎病模型造模成功。3.db/db小鼠相關(guān)生理指標的表征我們購買了一批db/db 16周小鼠。使用血糖儀檢測小鼠GLU,測量腎重、計算RKW以及通過ELISA試劑盒檢測糖尿病小鼠UACR,同時用PAS染色和免疫熒光的方法檢測糖原沉積和Nephrin、Podocin的表達量。通過以上指標和方法來驗證糖尿病腎病模型造模成功。4.檢測在糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)中MYDGF的表達情況當小鼠模型構(gòu)建成功后,通過Real-time RT-PCR和蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)的方法檢測MYDGF在糖尿病腎病小鼠腎臟中的表達變化。5.糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)刺激不同腎臟實質(zhì)細胞后檢測MYDGF的表達水平變化體外培養(yǎng)HPC、MPC、HK-2、RMC和GENC,分別給予AGE刺激48小時后抽提細胞內(nèi)蛋白,進行免疫印跡分析,檢測在AGE刺激下MYDGF在不同腎臟實質(zhì)細胞中的蛋白表達變化。6.體外AGE刺激下檢測在不同腎臟實質(zhì)細胞上清液中MYDGF的表達變化體外培養(yǎng)HPC、MPC、HK-2、RMC、GENC和分別給予AGE刺激48小時后取細胞上清液,通過ELISA方法檢測在不同腎臟實質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液中MYDGF的表達變化。7.利用免疫熒光方法檢測MYDGF在糖尿病腎病小鼠腎臟的表達分布及變化選取10周齡左右的雄性野生型C57BL/6J小鼠,單腎摘除恢復一周后,腹腔注射STZ,劑量為100mg/kg,連續(xù)注射三天誘導糖尿病腎病。當小鼠糖尿病腎病模型構(gòu)建成功后,利用免疫熒光雙染方法檢測糖尿病腎病小鼠腎小球中MYDGF的表達變化。第二部分:MYDGF在糖尿病腎病中的作用及機制初步探討1.流式細胞術(shù)檢測過表達MYDGF對AGE誘導的足細胞凋亡的影響體外培養(yǎng)HPC細胞,轉(zhuǎn)染MYDGF過表達質(zhì)粒后,給予AGE刺激48小時后,通過流式細胞術(shù)檢測足細胞凋亡的水平。2.利用蛋白印跡方法檢測過表達MYDGF對AGE誘導的足細胞損傷的影響。體外培養(yǎng)HPC細胞,轉(zhuǎn)染MYDGF過表達質(zhì)粒后,給予AGE刺激48小時,WB方法檢測足細胞功能蛋白Podocin、WT1和Nephrin的表達水平。3.利用蛋白免疫印跡法檢測過表達MYDGF對足細胞高糖條件下自噬水平的影響。體外培養(yǎng)HPC細胞,轉(zhuǎn)染MYDGF過表達質(zhì)粒后,給予AGE刺激48小時后,WB方法檢測自噬相關(guān)蛋白ATG12、LC3 Ⅱ、P62、beclin-1、ATG5和VPS34的表達水平。4.利用基因芯片技術(shù)分析差異基因通過基因芯片技術(shù)分析AGE誘導的足細胞損傷組和MYDGF過表達組間的差異表達基因,并繪制Wnt家族分子熱圖。研究結(jié)果第一部分:MYDGF在糖尿病腎病中的表達變化1.在WT小鼠主要臟器中,肝臟和腎臟的MYDGF表達量相對較高;在不同腎臟實質(zhì)細胞中RMC和GENC的MYDGF表達量相對較高首先對MYDGF在小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器中的表達情況進行了表征,RT-PCR和Real-time RT-PCR結(jié)果顯示MYDGFmRNA水平在腎臟和肝臟中的表達量相對較高,在心、脾、肺、腦中的表達量相對較低。MYDGF在RMC和GENC的表達量相對較高。2.STZ誘導的一型糖尿病腎病模型造模成功GLU、RKW和UACR結(jié)果顯示:與對照組小鼠相比,STZ誘導的糖尿病腎病小鼠的GLU、RKW、UACR都明顯升高。PAS染色結(jié)果也顯示與對照組小鼠相比,STZ誘導的糖尿病腎病小鼠糖原沉積與系膜增生明顯增加。IF實驗結(jié)果也顯示與對照組小鼠相比,STZ誘導的糖尿病腎病小鼠Nephrin和Podocin的表達量都明顯降低。3.db/db小鼠模型符合二型糖尿病腎病模型GLU、RKW和UACR的結(jié)果顯示:與對照組小鼠相比,db/db小鼠GLU、RKW、UACR都明顯升高。PAS染色結(jié)果也顯示與對照組小鼠相比,db/db小鼠糖原沉積與系膜增生明顯增加。免疫熒光實驗結(jié)果也顯示與對照組小鼠相比,db/db小鼠Nephrin和Podocin的表達量都明顯降低。4.MYDGF在糖尿病腎病小鼠腎臟中的表達水平明顯下降WB和Real-time RT-PCR結(jié)果表明,MYDGF在STZ誘導的糖尿病腎病模型組和db/db小鼠腎臟組織中與對照組相比表達顯著下降。5.AGE刺激能夠顯著下調(diào)足細胞中MYDGF蛋白水平蛋白免疫印跡結(jié)果表明,AGE可以顯著誘導HPC和MPC中的MYDGF的表達水平明顯下調(diào)。HK-2中MYDGF蛋白表達也有所下降,但GENC和RMC中MYDGF蛋白表達沒有明顯的變化,表明MYDGF在高糖條件下具有相對細胞特異性的變化。6.AGE刺激顯著下調(diào)人腎小球足細胞和小鼠腎小球足細胞上清液中MYDGF蛋白水平ELISA實驗結(jié)果表明,在HPC和MPC的細胞上清液中MYDGF的表達均下降。在HK-2的細胞上清液中MYDGF蛋白也有所下降。在RMC和GENC細胞上清液中MYDGF的表達沒有明顯變化。7.MYDGF在糖尿病腎病小鼠腎小球足細胞中表達水平明顯下調(diào)。雖然免疫熒光雙標實驗結(jié)果顯示MYDGF在腎小球足細胞和腎小管中均有表達,但與對照組相比,由STZ誘導的糖尿病腎病小鼠,MYDGF在足細胞內(nèi)下降更加顯著。第二部分:MYDGF在糖尿病腎病中的作用及機制初步探討1.MYDGF的過表達明顯減輕AGE誘導的足細胞凋亡流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,AGE可以明顯加重足細胞的凋亡,而過表達MYDGF可以明顯改善足細胞的凋亡。2.MYDGF的過表達改善AGE誘導的足細胞損傷。Western blot結(jié)果顯示,AGE可以明顯下調(diào)Podocin和WT1的表達,而過表MYDGF可明顯逆轉(zhuǎn)Podocin和WT1的下調(diào)。3.MYDGF的過表達上調(diào)足細胞自噬水平。Western blot結(jié)果顯示,AGE可以明顯下調(diào)ATG12和LC3 Ⅱ的表達,而過表MYDGF可明顯恢復ATG12和LC3 Ⅱ的表達。AGE可以明顯上調(diào)P62的表達,而過表MYDGF可明顯降低P62的表達。4.利用基因芯片技術(shù)分析差異基因通過基因芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Wnt家族部分成員在AGE誘導的足細胞損傷組中表達明顯降低,Wntl降低最明顯。MYDGF的過表達可明顯恢復損傷所誘導的這些基因的表達變化。結(jié)論與創(chuàng)新性:1.糖尿病腎病小鼠模型中MYDGF顯著降低,并且在AGE刺激下足細胞內(nèi)的MYDGF蛋白水平與上清中MYDGF 水平都明顯下調(diào),提示MYDGF與糖尿病腎病的發(fā)病機制密切相關(guān),且可能參與足細胞的損傷。2.MYDGF可能通過調(diào)節(jié)自噬水平和足細胞凋亡,進一步發(fā)揮對足細胞及腎臟的保護作用。
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