【摘要】：目的:研究齊墩果酸(Oleanolic acid,OA)在人膀胱癌細(xì)胞中的抗腫瘤能力,以及自噬在此過程中發(fā)揮的作用。方法:用不同濃度OA處理人膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ,CCK8實驗、平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖能力;用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白BAX,Bcl-2,Caspase-3表達(dá)水平。用m Cherry-GFPLC3B自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,熒光顯微鏡下監(jiān)測OA對細(xì)胞自噬水平的影響,Western blotting檢測LC3B-Ⅱ表達(dá)變化;Western blotting檢測p-AMPK、p-m TOR、p-ULK1等蛋白表達(dá)變化;通過自噬抑制劑3-甲基嘌呤(3-MA)、以及應(yīng)用si RNA ATG7和baflomycin A1抑制自噬后觀察OA引起的凋亡變化;用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素誘導(dǎo)自噬后觀察OA引起的凋亡變化;用AMPK抑制劑dorsomorphin抑制AMPK,觀察OA引起的保護(hù)性自噬的改變。結(jié)果:CCK-8實驗和平板克隆實驗證明OA可抑制T24及EJ細(xì)胞活性和增殖能力;流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)OA可誘導(dǎo)T24及EJ細(xì)胞發(fā)生凋亡,且具有濃度依賴性;OA可通過AMPK-m TOR-ULK1通路激活細(xì)胞自噬;抑制自噬或抑制AMPK可促進(jìn)OA引起的細(xì)胞凋亡,而激活自噬或激活A(yù)MPK則可抑制OA引起細(xì)胞凋亡。結(jié)論:OA在膀胱癌細(xì)胞中可發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),同時通過AMPK-mTOR-ULK1通路激活細(xì)胞自噬并與細(xì)胞耐藥相關(guān),聯(lián)合應(yīng)用OA及自噬抑制劑為膀胱癌的治療提供了新的策略。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié)果1．OA 抑制兩種人膀胱癌細(xì)胞的活性和增殖能力加入 OA 培養(yǎng) 24 小時后，，兩種人膀胱癌細(xì)胞系 T24 和 EJ 生長活性受抑制，且 OA 抑制細(xì)胞存活的效應(yīng)隨著其濃度增加而增強，具有濃度依賴性（圖1A）。在此基礎(chǔ)上，選取 7.5μM 和 15μM 作為合適濃度進(jìn)行下面實驗。集落形成實驗表明 OA 抑制了 T24 細(xì)胞和 EJ 細(xì)胞的增殖能力，且 OA 抑制細(xì)胞增值能力的效應(yīng)隨其濃度增加而增強（圖 1B、1C）。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文0.05 ，**p < 0.012．OA 誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞凋亡選取未使用 OA 培養(yǎng)及分別使用 7.5μM 和 15μM OA 培養(yǎng)的 T24 細(xì)胞和EJ 細(xì)胞，使用 Annexin V-FITC 和 PI 試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行染色，后置于流式計數(shù)儀中檢測。結(jié)果表明，OA 增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量，且隨其濃度增加凋亡細(xì)胞數(shù)量增加（圖 2A、2B）。為進(jìn)一步了解 OA 引起的細(xì)胞凋亡機制，因此我們檢測了 OA 對于一些凋亡相關(guān)蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白 BAX 和 cleavedcaspase-3 表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白 BCL-2 表達(dá)減少（圖 2C）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14

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本文編號：2634788