【摘要】：目的:膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,也是全身十大常見(jiàn)腫瘤之一,并且在我國(guó)泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率中排第一位。而近年來(lái)對(duì)膀胱癌的研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌細(xì)胞表面高表達(dá)的程序性死亡配體1(B7-H1,也稱(chēng)PD-L1)在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,因此針對(duì)B7-H1/PD-1途徑的研究也日益深入,并且針對(duì)該途徑的免疫靶向治療取得了明確的臨床療效;但是,接受這種治療的患者中仍有相當(dāng)一部分存在療效欠佳甚至無(wú)效的情況,導(dǎo)致不能通過(guò)該治療有效的治療膀胱癌,所以研究這些治療無(wú)效的膀胱癌患者機(jī)體中,發(fā)生了何種改變,將會(huì)為膀胱癌的治療提供新的突破點(diǎn)。而已知腫瘤細(xì)胞的生命活動(dòng)離不開(kāi)能量的代謝,作為對(duì)其生存有極其重要作用的免疫逃逸更是離不開(kāi)糖代謝的能量的供給,并且腫瘤細(xì)胞采取有氧糖酵解的方式供能已為大家所公認(rèn),所以本研究通過(guò)阻斷程序性死亡配體1(B7-H1)的表達(dá),探究膀胱癌糖代謝的改變,初步揭示膀胱癌細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生與腫瘤糖代謝之間的關(guān)系,并為那些接受B7-H1/PD-1途徑的免疫治療無(wú)效的患者,提供治療膀胱癌的新思路。方法:將培養(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞(T24細(xì)胞)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兩組,分別使用B7-H1的阻斷劑(MIH1型阻斷劑)和其溶劑PBS處理,各處理24h后,進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。首先將熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)作為光學(xué)探針培養(yǎng)兩組細(xì)胞,檢測(cè)培養(yǎng)0.5h后膀胱癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,來(lái)判斷膀胱癌細(xì)胞經(jīng)B7-H1阻斷后,攝取葡萄糖能力的改變情況;然后,將相同培養(yǎng)條件下(除B7-H1阻斷外無(wú)其他不同)兩組細(xì)胞的培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)后提取出來(lái),用乳酸試劑盒測(cè)量糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸的含量,以顯示膀胱癌細(xì)胞阻斷后糖酵解能力的差別;最后,將兩組細(xì)胞分別提取蛋白,并通過(guò)Western blot檢測(cè)糖酵解關(guān)鍵酶(HK-2、PKM-2、LDHA)以及相關(guān)信號(hào)通路(pten/pi3k/akt/m TOR)通路中Akt和活化的p Akt表達(dá)情況,反映具體影響糖酵解的信號(hào)機(jī)制。結(jié)果:(1)經(jīng)B7-H1阻斷劑阻斷24h后,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞表面B7-H1的表達(dá)量,對(duì)照組的為9.179±0.1255,而B(niǎo)7-H1阻斷組B7-H1的表達(dá)量為0.3957±0.02976,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明阻斷B7-H1后實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量極少;(2)B7-H1阻斷組的膀胱癌細(xì)胞與對(duì)照組膀胱癌細(xì)胞中2-NBDG的熒光強(qiáng)度相比,B7-H1阻斷組的熒光強(qiáng)度OD值為393.9±1.803,而對(duì)照組的為469.7±4.017,可以看出阻斷組熒光強(qiáng)度顯著下降,表明膀胱癌細(xì)胞的葡萄糖攝取能力下降;(3)B7-H1阻斷組癌細(xì)胞中的乳酸含量為0.8254±0.01993mmol/L,而對(duì)照組中的乳酸含量為1.227±0.01202 mmol/L,阻斷組與對(duì)照組相比,代謝產(chǎn)生的乳酸含量明顯下降,反映出阻斷B7H1后,膀胱癌細(xì)胞有氧糖酵解能力降低;(4)B7-H1阻斷組癌細(xì)胞中,糖酵解關(guān)鍵酶HK下降40.01%,LDHA下降49.56%,PKM-2下降35.82%,且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);介導(dǎo)糖酵解途徑信號(hào)通路蛋白AKT下降44.34%,其活性形式p-AKT下降44.68%,且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),表明B7-H1是通過(guò)降低HK-2、PKM-2、LDHA等糖酵解關(guān)鍵酶以及pten/pi3k/akt/m TOR蛋白合成降低,對(duì)膀胱癌細(xì)胞糖酵解途徑進(jìn)行阻斷的。結(jié)論:通過(guò)對(duì)膀胱癌細(xì)胞(T24細(xì)胞)中2-NBDG的熒光強(qiáng)度檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)B7-H1阻斷可以使膀胱癌細(xì)胞的攝取糖能力下降;并且通過(guò)對(duì)代謝產(chǎn)物乳酸,代謝關(guān)鍵酶HK-2、PKM-2、LDHA,以及信號(hào)通路中Akt、p Akt的分析,進(jìn)而我們得到初步結(jié)論,B7-H1通過(guò)阻斷代謝酶和信號(hào)通路中蛋白的合成,使得膀胱癌細(xì)胞糖酵解能力下降,此途徑可為治療膀胱癌提供新思路。
【圖文】：

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 經(jīng) MIH1 阻斷 B7H1 后，B7H1 表達(dá)量降低為了阻斷膀胱癌細(xì)胞（T24 細(xì)胞）的糖代謝過(guò)程，我們?cè)谂囵B(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞入 B7H1 阻斷型抗體 MIH1 進(jìn)行 B7H1 的表達(dá)阻斷來(lái)實(shí)驗(yàn)這一實(shí)驗(yàn)?zāi)康�。MIH1 和試劑處理 T24 細(xì)胞 24h 時(shí)間后，通過(guò)與單克隆抗體 B7-H1-PE 熒光抗體結(jié)合，式細(xì)胞儀測(cè)得熒光強(qiáng)度值，通過(guò)熒光強(qiáng)度來(lái)反應(yīng) B7H1 的表達(dá)量變化。對(duì)照組膀細(xì)胞組的 B7H1 的表達(dá)量為 9.179 ± 0.1255（Mean±SD，圖 1B），而 B7H1 阻斷H1 的表達(dá)量為 0.3957 ± 0.02976（Mean±SD，圖 1A），兩組之間有顯著差異（對(duì) t 檢驗(yàn)，P<0.0001, N=3），說(shuō)明 MIH1 處理，對(duì) T24 細(xì)胞中 B7H1 的表達(dá)存在的阻斷作用。結(jié)果如下圖 1 所示。

圖 3 T24 細(xì)胞經(jīng) MIH1 抗體阻斷 B7H1 表達(dá)的乳酸含量為 1.227 ± 0.01202 mmol/L，而下降到 0.8254 ± 0.01993 mmol/（配對(duì) t 檢驗(yàn)3.4 B7H1 阻斷使 T24 細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶平下降膀胱癌 T24 細(xì)胞中，存在多種糖酵解關(guān)鍵酶致使其糖酵解能力增強(qiáng)以維持其不受控的生長(zhǎng)過(guò)阻斷 B7H1 可以降低 T24 細(xì)胞系的糖酵解能力中的關(guān)鍵酶和信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平是否發(fā)細(xì)胞中蛋白，進(jìn)行 Western blot 試驗(yàn)。我們發(fā)細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)量均有所下降，其中PKM-2 下降 35.82%，，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（非配導(dǎo)糖酵解途徑的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵酶 Akt
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：2632890