【摘要】：目的:膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,也是全身十大常見腫瘤之一,并且在我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率中排第一位。而近年來對膀胱癌的研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌細胞表面高表達的程序性死亡配體1(B7-H1,也稱PD-L1)在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,因此針對B7-H1/PD-1途徑的研究也日益深入,并且針對該途徑的免疫靶向治療取得了明確的臨床療效;但是,接受這種治療的患者中仍有相當一部分存在療效欠佳甚至無效的情況,導致不能通過該治療有效的治療膀胱癌,所以研究這些治療無效的膀胱癌患者機體中,發(fā)生了何種改變,將會為膀胱癌的治療提供新的突破點。而已知腫瘤細胞的生命活動離不開能量的代謝,作為對其生存有極其重要作用的免疫逃逸更是離不開糖代謝的能量的供給,并且腫瘤細胞采取有氧糖酵解的方式供能已為大家所公認,所以本研究通過阻斷程序性死亡配體1(B7-H1)的表達,探究膀胱癌糖代謝的改變,初步揭示膀胱癌細胞免疫逃逸的發(fā)生與腫瘤糖代謝之間的關(guān)系,并為那些接受B7-H1/PD-1途徑的免疫治療無效的患者,提供治療膀胱癌的新思路。方法:將培養(yǎng)的膀胱癌細胞(T24細胞)分為實驗組及對照組兩組,分別使用B7-H1的阻斷劑(MIH1型阻斷劑)和其溶劑PBS處理,各處理24h后,進行下列實驗。首先將熒光標記2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)作為光學探針培養(yǎng)兩組細胞,檢測培養(yǎng)0.5h后膀胱癌細胞的熒光強度,來判斷膀胱癌細胞經(jīng)B7-H1阻斷后,攝取葡萄糖能力的改變情況;然后,將相同培養(yǎng)條件下(除B7-H1阻斷外無其他不同)兩組細胞的培養(yǎng)液經(jīng)過24h培養(yǎng)后提取出來,用乳酸試劑盒測量糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸的含量,以顯示膀胱癌細胞阻斷后糖酵解能力的差別;最后,將兩組細胞分別提取蛋白,并通過Western blot檢測糖酵解關(guān)鍵酶(HK-2、PKM-2、LDHA)以及相關(guān)信號通路(pten/pi3k/akt/m TOR)通路中Akt和活化的p Akt表達情況,反映具體影響糖酵解的信號機制。結(jié)果:(1)經(jīng)B7-H1阻斷劑阻斷24h后,使用流式細胞儀檢測膀胱癌細胞表面B7-H1的表達量,對照組的為9.179±0.1255,而B7-H1阻斷組B7-H1的表達量為0.3957±0.02976,P0.05,差異有統(tǒng)計學意義,說明阻斷B7-H1后實驗組表達量極少;(2)B7-H1阻斷組的膀胱癌細胞與對照組膀胱癌細胞中2-NBDG的熒光強度相比,B7-H1阻斷組的熒光強度OD值為393.9±1.803,而對照組的為469.7±4.017,可以看出阻斷組熒光強度顯著下降,表明膀胱癌細胞的葡萄糖攝取能力下降;(3)B7-H1阻斷組癌細胞中的乳酸含量為0.8254±0.01993mmol/L,而對照組中的乳酸含量為1.227±0.01202 mmol/L,阻斷組與對照組相比,代謝產(chǎn)生的乳酸含量明顯下降,反映出阻斷B7H1后,膀胱癌細胞有氧糖酵解能力降低;(4)B7-H1阻斷組癌細胞中,糖酵解關(guān)鍵酶HK下降40.01%,LDHA下降49.56%,PKM-2下降35.82%,且均有統(tǒng)計學意義(p0.05);介導糖酵解途徑信號通路蛋白AKT下降44.34%,其活性形式p-AKT下降44.68%,且均有統(tǒng)計學意義(p0.05),表明B7-H1是通過降低HK-2、PKM-2、LDHA等糖酵解關(guān)鍵酶以及pten/pi3k/akt/m TOR蛋白合成降低,對膀胱癌細胞糖酵解途徑進行阻斷的。結(jié)論:通過對膀胱癌細胞(T24細胞)中2-NBDG的熒光強度檢測,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)B7-H1阻斷可以使膀胱癌細胞的攝取糖能力下降;并且通過對代謝產(chǎn)物乳酸,代謝關(guān)鍵酶HK-2、PKM-2、LDHA,以及信號通路中Akt、p Akt的分析,進而我們得到初步結(jié)論,B7-H1通過阻斷代謝酶和信號通路中蛋白的合成,使得膀胱癌細胞糖酵解能力下降,此途徑可為治療膀胱癌提供新思路。
【圖文】：

青島大學碩士學位論文3 實驗結(jié)果1 經(jīng) MIH1 阻斷 B7H1 后，B7H1 表達量降低為了阻斷膀胱癌細胞（T24 細胞）的糖代謝過程，我們在培養(yǎng)的膀胱癌細胞入 B7H1 阻斷型抗體 MIH1 進行 B7H1 的表達阻斷來實驗這一實驗?zāi)康摹IH1 和試劑處理 T24 細胞 24h 時間后，通過與單克隆抗體 B7-H1-PE 熒光抗體結(jié)合，式細胞儀測得熒光強度值，通過熒光強度來反應(yīng) B7H1 的表達量變化。對照組膀細胞組的 B7H1 的表達量為 9.179 ± 0.1255（Mean±SD，圖 1B），而 B7H1 阻斷H1 的表達量為 0.3957 ± 0.02976（Mean±SD，圖 1A），兩組之間有顯著差異（對 t 檢驗，P<0.0001, N=3），說明 MIH1 處理，對 T24 細胞中 B7H1 的表達存在的阻斷作用。結(jié)果如下圖 1 所示。

圖 3 T24 細胞經(jīng) MIH1 抗體阻斷 B7H1 表達的乳酸含量為 1.227 ± 0.01202 mmol/L，而下降到 0.8254 ± 0.01993 mmol/（配對 t 檢驗3.4 B7H1 阻斷使 T24 細胞中糖酵解關(guān)鍵酶平下降膀胱癌 T24 細胞中，存在多種糖酵解關(guān)鍵酶致使其糖酵解能力增強以維持其不受控的生長過阻斷 B7H1 可以降低 T24 細胞系的糖酵解能力中的關(guān)鍵酶和信號通路蛋白的表達水平是否發(fā)細胞中蛋白，進行 Western blot 試驗。我們發(fā)細胞中糖酵解關(guān)鍵酶的表達量均有所下降，其中PKM-2 下降 35.82%，，且均有統(tǒng)計學意義（非配導糖酵解途徑的信號傳導通路中的關(guān)鍵酶 Akt
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14

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本文編號：2632890