【摘要】：前列腺癌(Prostate Cancer)是目前全世界最常見(jiàn)的男性惡性腫瘤之一,在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家癌癥致死率排名中位居第二位。我國(guó)近年來(lái)前列腺癌發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì),因此,針對(duì)前列腺癌開(kāi)展有效的防治措施具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。前列腺癌起病隱匿,生長(zhǎng)較為緩慢,早期前列腺癌可無(wú)任何臨床癥狀。而一旦出現(xiàn)癥狀,常屬較晚期的進(jìn)展性前列腺癌,就診時(shí)多數(shù)患者已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。前列腺癌惡性程度高,發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確,年齡、種族及遺傳家族史均與發(fā)病密切相關(guān)。對(duì)于早期局限性前列腺癌,綜合考慮患者年齡、腫瘤臨床分期、血清前列腺特異性抗原、格里森評(píng)分及前列腺活檢陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)量等多種因素,可以選擇主動(dòng)監(jiān)測(cè)或根治性前列腺癌切除術(shù)。但如前文所述,前列腺癌起病隱匿,多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,錯(cuò)失手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。由于86-98%的前列腺癌為雄激素依賴型腫瘤,目前針對(duì)晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌的經(jīng)典治療策略是雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy,ADT),也稱為去勢(shì)療法,但多數(shù)患者在1-2年內(nèi)對(duì)ADT發(fā)生耐藥,進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗型前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer,mCRPC)。新近研發(fā)的ADT藥物恩雜魯胺及阿比特龍可明顯改善患者生存率,被認(rèn)為是mCRPC治療方面的突破進(jìn)展,但20-40%的患者對(duì)恩雜魯胺及阿比特龍并不敏感(原發(fā)耐受),其余敏感患者最終也幾乎都會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)耐受�；熞彩乔傲邢侔┲饕闹委煼椒ㄖ�,可以延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。但化療藥物均有一定藥物毒性,身體狀態(tài)、骨髓功能或肝腎功能較差的患者通常不能耐受。免疫療法(如sipuleucel-T)為mCRPC的治療提供了新的方向,但相對(duì)嚴(yán)格的使用適應(yīng)癥和較高的經(jīng)濟(jì)成本限制其使用。目前已有大量的治療前列腺癌的新藥進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),甚至進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,如卡博替尼(一種酪氨酸激酶抑制劑)。然而,這些新藥從研發(fā)到臨床還需要數(shù)年的時(shí)間。因此,尋找一種安全、有效的藥物治療方法仍然是目前前列腺癌治療中需要迫切解決的問(wèn)題。非諾貝特作為一種降脂藥物,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。其化學(xué)成分為2-甲基-2-[4-(4-氯苯甲�；�)苯氧基]丙酸異丙酯,它藥效穩(wěn)定、使用安全、價(jià)格低廉,已被臨床廣泛應(yīng)用于高膽固醇血癥和高脂血癥的治療。此外,非諾貝特還被證實(shí)具有預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎臟病變、糖尿病心肌病變,以及其他糖尿病微血管并發(fā)癥的作用。越來(lái)越多的研究證明非諾貝特在某些惡性腫瘤的發(fā)生過(guò)程中還具有抗腫瘤細(xì)胞增殖和促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,如乳腺癌、子宮頸癌癥、肝癌和前列腺癌。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)非諾貝特可通過(guò)激活氧化應(yīng)激反應(yīng),來(lái)抑制雄激素受體表達(dá)水平并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抑制雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的生長(zhǎng)的作用。目前,治療mCRPC是臨床治療前列腺癌的難點(diǎn),也是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。因此,本論文主要探討非諾貝特是否能夠抑制雄激素非依賴型前列腺癌PC-3細(xì)胞(可模擬臨床mCRPC)生長(zhǎng)及相關(guān)分子機(jī)制,并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本論文所得到的結(jié)果如下:(1)MTT法測(cè)定PC-3細(xì)胞在不同濃度的非諾貝特作用24、48和72 h的增殖情況。結(jié)果顯示,非諾貝特明顯抑制PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng),且這種抑制作用呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。(2)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析非諾貝特引起的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,非諾貝特處理24、48及72 h的凋亡細(xì)胞總百分比分別為8.5±1.87%,12.63±2.59%和25.53±7.77%,較對(duì)照組3.83±0.64%明顯升高。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要指標(biāo)caspase 3和AIF。結(jié)果顯示,非諾貝特處理24小時(shí)后明顯增加了cleaved caspase 3和AIF的表達(dá)。上述結(jié)果說(shuō)明非諾貝特抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)主要是通過(guò)激活caspase3和AIF從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。(3)非諾貝特處理PC-3細(xì)胞后,Bad表達(dá)升高,Bcl-2和Survivin表達(dá)降低。說(shuō)明非諾貝特通過(guò)提高Bad的表達(dá),降低Bcl-2和survivin的表達(dá),誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡。(4)非諾貝特處理PC-3細(xì)胞0.5-24 h,p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K比值明顯下降。100nM雷帕霉素(mTOR抑制劑)處理后,非諾貝特的抗增殖作用與雷帕霉素相同,且雷帕霉素能夠進(jìn)一步提高非諾貝特的抗增殖能力。說(shuō)明抑制mTOR的磷酸化可以抑制PC-3細(xì)胞增殖,非諾貝特抑制PC-3細(xì)胞增殖是通過(guò)抑制mTOR/p70S6K細(xì)胞通路實(shí)現(xiàn)的。(5)非諾貝特處理PC-3細(xì)胞后沒(méi)有激活PI3K,但作用0.5 h及48 h時(shí)p-AKT/AKT比值升高。非諾貝特處理0.5 h至48 h時(shí)p-P38/P38比值增加,但對(duì)JNK表達(dá)沒(méi)有影響。非諾貝特處理0.5 h至3 h時(shí)p-AMPKα/AMPKα比值明顯降低,但作用24h時(shí)p-AMPKα/AMPKα比值明顯升高。上述結(jié)果說(shuō)明非諾貝特對(duì)mTOR/p70S6K通路的抑制作用不通過(guò)PI3K/AKT及JNK通路,可能與增加P38 MAPK和AMPKα磷酸化有關(guān)。(6)10μM SB203580(P38 MAPK抑制劑)沒(méi)有消除非諾貝特對(duì)PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,反而明顯提高了非諾貝特的抗增殖能力。同樣,5μM Compound C(AMPK抑制劑)也沒(méi)有消除非諾貝特對(duì)PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,反而明顯提高了非諾貝特的抗增殖能力。說(shuō)明非諾貝特對(duì)mTOR/p70S6K通路的抑制作用不通過(guò)P38 MAPK和AMPKα通路,但抑制P38 MAPK和AMPK明顯增加了非諾貝特對(duì)PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。(7)將2×10~6/0.1ml的PC-3細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部皮下,構(gòu)建前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100mm~3時(shí),將裸鼠分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。非諾貝特溶液200mg/kg每日1次灌胃3周后,藥物組腫瘤體積、腫瘤重量及腫瘤重量/體重比值較對(duì)照組明顯下降,但兩組裸鼠體重未見(jiàn)明顯差異,說(shuō)明非諾貝特對(duì)移植瘤有抑制作用,且未見(jiàn)明顯副作用。本論文得出了如下的結(jié)論:(1)非諾貝特抑制PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng),且這種抑制作用呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性;(2)非諾貝特抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)主要是通過(guò)抑制mTOR/p70S6K細(xì)胞通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。非諾貝特抑制mTOR磷酸化,繼而減少P70S6K激活,引起B(yǎng)ad表達(dá)增多與Bcl-2表達(dá)降低,通過(guò)線粒體途徑激活caspase3并增加AIF釋放,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。P70S6K激活減少同時(shí)引起survivin表達(dá)量降低,caspase3激活增加,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;(3)非諾貝特對(duì)mTOR/p70S6K通路的抑制作用不通過(guò)PI3K/AKT、MAPKs和AMPK通路,但抑制P38 MAPK和AMPK明顯增加了非諾貝特對(duì)PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用;(4)非諾貝特對(duì)前列腺癌裸鼠皮下移植瘤具有抑制作用,且未見(jiàn)明顯副作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：2619132