發(fā)布時(shí)間：2021-08-18 15:22

  研究背景前列腺癌是一種嚴(yán)重影響人類生命健康的疾病,位居男性惡性腫瘤發(fā)病率第二位,同時(shí),前列腺癌所導(dǎo)致的死亡病例數(shù)在所有腫瘤中排第五位。我國(guó)前列腺癌發(fā)病率較低,但近年來(lái)隨著人口老齡化、肥胖、生活方式西方化和前列腺癌診斷技術(shù)的提高,我國(guó)前列腺癌患者數(shù)量呈高速增長(zhǎng)趨勢(shì),年增長(zhǎng)率達(dá)5%。雄激素受體(Androgen Receptor,AR)是前列腺發(fā)育和前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要分子,它在與雙氫睪酮等配體結(jié)合后,通過(guò)與雄激素依賴性基因啟動(dòng)子區(qū)域的雄激素反應(yīng)元件結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子的輔助下,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。AR通過(guò)調(diào)控一系列下游基因的表達(dá),促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、抗凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等功能。鑒于AR在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用,目前針對(duì)進(jìn)展期前列腺癌,一線治療方案是雄激素剝奪治療(Androgen Deprivation Therapy,ADT)。在治療初期,腫瘤細(xì)胞往往表現(xiàn)為對(duì)治療較高的敏感性,但是,大多數(shù)前列腺癌經(jīng)ADT治療12-18個(gè)月后發(fā)生復(fù)發(fā),并產(chǎn)生對(duì)雄激素剝奪的抵抗,轉(zhuǎn)變?yōu)槿?shì)抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPC),在大部分CRPC病例中均存在AR信號(hào)通路的重激活。因此,AR在前列腺癌進(jìn)展和腫瘤復(fù)發(fā)中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)移性前列腺癌的差異基因進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)了前列腺癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)差異基因,Rac GTP酶激活蛋白1(RacGAP1)。RacGAP1屬于Rho小G蛋白家族,可以激活Rho蛋白的GTP酶水解活性,水解與之相連的GTP,使Rho蛋白失活。RacGAP1也是中心紡錘體的重要組成成分,控制胞質(zhì)分裂收縮環(huán)的形成和其與細(xì)胞膜的錨定,在細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要作用。此外,RacGAP1還參與STAT3激活和p-STAT3的入核,在其轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮中起關(guān)鍵調(diào)控作用,而STAT3可以在轉(zhuǎn)錄水平影響RacGAP1的表達(dá);RacGAP1對(duì)HIF-1 α起負(fù)向調(diào)控作用,并通過(guò)HIF-1 α參與細(xì)胞缺氧調(diào)控。RacGAP1與畸形精子癥、小鼠不育癥、病毒感染等疾病有關(guān)。同時(shí),RacGAP1的表達(dá)失調(diào)也與許多腫瘤相關(guān)。RacGAP1通過(guò)抑制Hippo/YAP信號(hào)通路,促進(jìn)胞質(zhì)分裂的發(fā)生,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖;RacGAP1通過(guò)對(duì)Rho蛋白的調(diào)控促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移;RacGAP1與STAT3的調(diào)控環(huán)路在腫瘤中也發(fā)揮重要作用,可以促進(jìn)膀胱癌、肝癌等腫瘤進(jìn)展。RacGAP1的高表達(dá)還與結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌和腦膜瘤等癌癥的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲及不良預(yù)后相關(guān)。RacGAP1也在前列腺癌中存在表達(dá)失調(diào),但其機(jī)制尚不明確。因此我們將關(guān)注點(diǎn)放在RacGAP1是否與前列腺癌的生物學(xué)行為有關(guān),以及RacGAP1在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中的作用和機(jī)制上,希望可以對(duì)這一嚴(yán)重危害人類健康的疾病有更深入的理解。研究目的1、尋找前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的差異表達(dá)基因;2、探究RacGAP1與前列腺癌進(jìn)展的關(guān)系;3、探究RacGAP1與雄激素受體的關(guān)系;4、探究RacGAP1在前列腺癌中發(fā)揮作用的機(jī)制。研究方法一、尋找前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的差異基因1、使用多個(gè)GEO數(shù)據(jù)庫(kù),篩選轉(zhuǎn)移性前列腺癌和原發(fā)性前列腺癌之間的差異基因,通過(guò)GO(Gene Ontology)功能分析,確定研究對(duì)象;2、使用TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù),探究RacGAP1與前列腺癌臨床病理指標(biāo)、患者預(yù)后的聯(lián)系;3、使用我們的前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)RacGAP1與前列腺癌指標(biāo)的關(guān)系。二、RacGAP1在前列腺癌中的作用1、Western blot和RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系RacGAP1表達(dá)量;2、篩選RacGAP1 siRNA和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,Western blot及RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;3、使用MTS、EdU、Transwell和細(xì)胞劃痕等實(shí)驗(yàn),檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等能力。三、RacGAP1與雄激素受體的關(guān)系1、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析,探究去勢(shì)/雄激素對(duì)RacGAP1表達(dá)的影響;2、使用LNCaP細(xì)胞檢測(cè)RacGAP1是否具有雄激素反應(yīng)性(劑量/時(shí)間);LNCaP細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間剝奪雄激素培養(yǎng),檢測(cè)RacGAP1表達(dá)變化;3、干擾/過(guò)表達(dá)AR,檢測(cè)RacGAP1表達(dá)變化;4、軟件預(yù)測(cè)RACGAP1基因啟動(dòng)子區(qū)域有無(wú)雄激素反應(yīng)元件(Androgen Responding Elements,ARE);5、ChIP實(shí)驗(yàn)探究AR是否可以直接結(jié)合到RacGAP1基因啟動(dòng)子上。四、RacGAP1在AR信號(hào)通路介導(dǎo)的前列腺癌進(jìn)展中是否發(fā)揮作用通過(guò)拯救實(shí)驗(yàn),檢測(cè)RacGAP1在AR介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞增殖中是否發(fā)揮作用。五、RacGAP1在前列腺癌中的作用機(jī)制1、Western blot檢測(cè)RacGAP1對(duì)細(xì)胞周期蛋白的影響;2、DU145細(xì)胞瞬時(shí)干擾RacGAP1表達(dá)后,送表達(dá)譜芯片檢測(cè),差異表達(dá)基因;3、GSEA預(yù)測(cè)RacGAP1可能的下游基因:4、干擾/過(guò)表達(dá)RacGAP1后,檢測(cè)相關(guān)基因及蛋白質(zhì)表達(dá)變化。研究結(jié)果一、在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中,RacGAP1表達(dá)顯著上調(diào)通過(guò)分析對(duì)比兩個(gè)轉(zhuǎn)移性前列腺癌的數(shù)據(jù)庫(kù),尋找轉(zhuǎn)移性前列腺癌中表達(dá)上調(diào)的基因;細(xì)胞骨架和細(xì)胞周期相關(guān)分子在腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,因此,我們進(jìn)行了 GO功能分析,尋找與細(xì)胞骨架和細(xì)胞周期相關(guān)的差異基因;在這些基因中,同時(shí)與細(xì)胞骨架和細(xì)胞周期有關(guān)的基因有35個(gè),綜合比較兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集,RacGAP1是其中表達(dá)變化倍數(shù)較大的基因,因此選取RacGAP1作為本課題的研究對(duì)象。接下來(lái),我們分析了 RacGAP1與前列腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)資料中,我們分析發(fā)現(xiàn),RacGAP1的高表達(dá)與較高的臨床/病理T分期、Gleason評(píng)分、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān);在我們的腫瘤樣本中進(jìn)行的免疫組化實(shí)驗(yàn),也發(fā)現(xiàn)RacGAP1與較高的Gleason評(píng)分相關(guān);RacGAP1高表達(dá)與前列腺癌生化復(fù)發(fā)密切相關(guān)。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,我們得出結(jié)論,在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中,RacGAP1表達(dá)顯著上調(diào)。二、RacGAP1具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移的能力在前列腺癌細(xì)胞系中,我們檢測(cè)了RacGAP1的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,RacGAP1在VCaP、DU145細(xì)胞中高表達(dá),在LNCaP細(xì)胞中表達(dá)較低;在細(xì)胞水平進(jìn)行的功能實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),RacGAP1在細(xì)胞水平發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成能力。以上結(jié)果證明了RacGAP1具有促進(jìn)前列腺癌增殖轉(zhuǎn)移的能力。三、RacGAP1是受AR調(diào)控的雄激素誘導(dǎo)性基因AR在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中均發(fā)揮重要作用,因此,接下來(lái),我們對(duì)RacGAP1與AR的關(guān)系進(jìn)行了探究。我們先使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)(GSE22483和GSE8702)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,RacGAP1受雄激素和AR正向調(diào)控,剝奪雄激素后,RacGAP1表達(dá)呈先降低,后升高趨勢(shì);在我們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,也發(fā)現(xiàn),在較長(zhǎng)時(shí)間的雄激素剝奪過(guò)程中,RacGAP1表達(dá)呈現(xiàn)為先降低再升高;在細(xì)胞培養(yǎng)中加入雄激素,RacGAP1呈現(xiàn)出對(duì)雄激素在時(shí)間和劑量上的依賴性。在LNCaP細(xì)胞中干擾/過(guò)表達(dá)AR表達(dá)后,RacGAP1的mRNA和蛋白水平均隨AR正向變化。AR是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,因此我們猜測(cè)AR可以在轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)RacGAP1發(fā)揮直接的調(diào)控作用。使用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,RacGAP1啟動(dòng)子區(qū)域有AR結(jié)合位點(diǎn);使用ChIP實(shí)驗(yàn)對(duì)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果證實(shí),AR可以直接結(jié)合到RacGAP1的啟動(dòng)子上,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。而RacGAP1可以作為分子伴侶,對(duì)一些核蛋白的入核和激活具有促進(jìn)作用,因此我們猜測(cè)RacGAP1可能對(duì)AR入核和激活也具有促進(jìn)作用。但CoIP實(shí)驗(yàn)證實(shí),RacGAP1不能通過(guò)結(jié)合AR,對(duì)AR發(fā)揮分子伴侶功能;而RacGAP1對(duì)AR下游基因的表達(dá)也不具有調(diào)控作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,RacGAP1是一個(gè)雄激素誘導(dǎo)性基因,可以被AR轉(zhuǎn)錄激活。四、RacGAP1在AR信號(hào)通路介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用在前一部分實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)RacGAP1被AR轉(zhuǎn)錄激活,因此我們猜測(cè),RacGAP1可能作為AR下游分子,在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用。在LNCaP細(xì)胞中干擾AR表達(dá)后,RacGAP1表達(dá)下調(diào),同時(shí)細(xì)胞增殖能力降低,但當(dāng)干擾AR,再過(guò)表達(dá)RacGAP1后,細(xì)胞增殖能力得到一定的逆轉(zhuǎn);而在過(guò)表達(dá)AR后,RacGAP1表達(dá)上調(diào),細(xì)胞增殖能力增高,在此基礎(chǔ)上,再干擾RacGAP1表達(dá),可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的降低。從這一部分的實(shí)驗(yàn)中,我們得到結(jié)論,RacGAP1參與AR介導(dǎo)的前列腺癌進(jìn)展過(guò)程。五、RacGAP1對(duì)下游分子的調(diào)控接下來(lái),我們對(duì)RacGAP1在前列腺癌進(jìn)展中的作用機(jī)制進(jìn)行了探究。在DU145細(xì)胞中干擾RacGAP1表達(dá)后,送基因組表達(dá)譜芯片分析。對(duì)表達(dá)譜芯片結(jié)果進(jìn)行基因集富集性分析(GSEA),發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在BMI1、MYC、mTOR和E2F等與腫瘤相關(guān)的通路;接下來(lái),我們對(duì)GSEA分析結(jié)果進(jìn)行Western blot和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果顯示,RacGAP1可以在蛋白水平正向調(diào)控C-MYC表達(dá),RacGAP1可以上調(diào)c-Myc下游基因表達(dá)。我們檢測(cè)了細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,RacGAP1可以調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。研究結(jié)論1、在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中,RacGAP1表達(dá)水平顯著升高;2、RacGAP1在前列腺癌中的高表達(dá)與較高的臨床分期、高Gleason評(píng)分、轉(zhuǎn)移、和生化復(fù)發(fā)有關(guān);3、RacGAP1是受AR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雄激素誘導(dǎo)性基因;4、RacGAP1作為AR下游分子,在前列腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用;5、RacGAP1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期以及c-Myc等重要致癌分子活性,發(fā)揮促癌作用。【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【圖文】：

ＡＲ對(duì)前列腺的正常發(fā)育至關(guān)重要。它通過(guò)調(diào)控包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子逡逑（ＦＧＦ）、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子（ＩＧＦ）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在逡逑內(nèi)眾多生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和正常分化＾２：。ＡＲ在前列腺逡逑癌的進(jìn)展中也發(fā)揮重要作用。ＡＲ可以發(fā)揮抗凋亡功能，有研究顯示，ＡＲ通路的逡逑激活可以上調(diào)Ｆ０Ｘ０３ａ和ＦＬＩＰ蛋白的表達(dá)，這兩種蛋白是重要的抗凋亡因子％邋；逡逑而干擾ＡＲ表達(dá)，可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡［２４：。ＡＲ與ＴＧＦＰ協(xié)同作用，對(duì)下逡逑游轉(zhuǎn)錄因子Ｒｕｎｘ２進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖；ＡＲ還可以通過(guò)激活Ｓｍａｄ３、逡逑Ｓｍａｄ４和ＩＬ－６等分子，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的功能［２Ｍ８；。除此之外，ＡＲ也發(fā)逡逑揮促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移的作用，ＡＲ通過(guò)上調(diào)ＭＭＰ－２蛋白質(zhì)表達(dá)水平和ＥＲＭ蛋白的逡逑磷酸化水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)ｒａ：。ＡＲ還通過(guò)與細(xì)胞骨架蛋．白細(xì)絲蛋逡逑白Ａ組成復(fù)合體，發(fā)揮招募整聯(lián)蛋白Ｐ邋１以及控制黏著斑激酶、|У鞍綴停遙幔愕板義習(xí)妝澩锏淖饔�，磦蝤促进肿留湼胞转移｀P浚ⅲ骸Ｉ掀ぃ涑渲首ā福蓿備跡叮保矗保義希恚澹螅澹睿悖瑁恚幔戾澹簦潁幔睿螅椋簦椋錚�，ＥＭＴ）是恶袨�(zāi)琢鱟頻鬧匾蹋醒芯肯允荊粒義義稀，

本文編號(hào)：2616121