發(fā)布時間：2020-04-06 04:59

【摘要】：前言:腎臟的功能隨年齡增長而逐年下降,衰老是進(jìn)展性腎臟疾病的一個重要的危險因素。正常的衰老過程是器官對各種急性和慢性傷害做出的動態(tài)平衡的響應(yīng)。學(xué)術(shù)界將衰老定義為:隨年齡增長而發(fā)生的機體功能下降及生理功能紊亂的全身性表現(xiàn)。腎臟是人體中有重要生理功能和意義的器官,也是衰老出現(xiàn)較早的器官。我國是人口大國,隨著經(jīng)濟的發(fā)展和社會的進(jìn)步,我國正逐漸步入老齡化社會,而老年人正是慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)的高危人群。腎臟的衰老可以體現(xiàn)在大體(病理)層面和細(xì)胞層面,在其衰老過程中無論整體功能、結(jié)構(gòu),還是細(xì)胞水平的細(xì)胞功能,甚至分子生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)等層面都會發(fā)生一系列復(fù)雜的改變。細(xì)胞水平的衰老目前沒有統(tǒng)一的金標(biāo)準(zhǔn),而腎臟從整體到細(xì)胞系統(tǒng)的衰老相關(guān)研究更是極為少見。因此,探索衰老過程中各相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化及機制,顯得尤為重要。細(xì)胞水平的衰老作為器官衰老的重要分子標(biāo)志之一,同時也參與調(diào)節(jié)腎臟衰老的進(jìn)程。端粒與非端粒因素(例如氧化應(yīng)激、線粒體DNA損傷等)最終通過p16/Rb或ARF/p53途徑導(dǎo)致應(yīng)激性早老性衰老的發(fā)生,導(dǎo)致腎臟對損傷的敏感性增加,修復(fù)能力下降,最終導(dǎo)致腎臟的衰老。盡管單一的細(xì)胞衰老標(biāo)志仍未明確,但是一些研究通過體內(nèi)細(xì)胞衰老的實驗逐漸發(fā)現(xiàn)了一些相對可靠的標(biāo)志物,例如p53、p21、p16、Rb及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,β-gal)。大部分研究認(rèn)為腎臟衰老主要是由于腎臟固有細(xì)胞功能減退所致,而腎小球系膜細(xì)胞(Mesangial cells,MCs)是腎臟重要的固有細(xì)胞之一,具有維持腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡的重要作用,其表型和功能改變在腎臟衰老進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。STAT5可以以多種方式介導(dǎo)細(xì)胞的衰老。有文獻(xiàn)指出,在肺癌中,組成性激活的STAT5可以介導(dǎo)細(xì)胞線粒體功能受損,產(chǎn)生過量活性氧,最終直接引起氧化性DNA損傷效應(yīng)(DNA Damage Response,DDR)DDR導(dǎo)致P53表達(dá)上調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致衰老的發(fā)生。STAT5也可通過間接方式在細(xì)胞衰老的過程中起作用。同源或異源的STAT5二聚體進(jìn)入細(xì)胞核后可以調(diào)控多種下游基因的表達(dá),如:細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinD1、cyclin D2、p21WAF/Cip1、p27kip,以及抗凋亡基因Bcl-xl和Bcl-2,進(jìn)而影響細(xì)胞的衰老過程。然而這些研究成果多集中于腫瘤領(lǐng)域,在腎臟中,尤其在腎小球系膜細(xì)胞中,幾乎沒有相關(guān)報道。自噬是細(xì)胞通過溶酶體對自身損傷、衰老的細(xì)胞器及生物大分子等進(jìn)行吞噬降解,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種保護機制,在人類的免疫、感染、炎癥、腫瘤、心血管病等疾病的發(fā)病中具有十分重要的作用。自噬又被劃分為:巨自噬(macroautophagy)、分子伴侶自噬(chaperone-mediated autophagy)和微自噬(microautophagy),其中巨自噬是自噬最經(jīng)典、特征最為完整的形式,因此本研究中選取巨自噬作為觀察的對象。細(xì)胞外有高血糖、終末糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)等刺激因子,細(xì)胞內(nèi)處于氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等病理狀態(tài),均會導(dǎo)致哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),腺苷酸活化蛋白激酶和氧化輔酶依賴的組蛋白去乙酰化酶等主要營養(yǎng)信號通路的異常,從而影響自噬功能。自噬活性下降可能會導(dǎo)致受損細(xì)胞器和衰老相關(guān)性修飾蛋白無法有效清除,在細(xì)胞內(nèi)聚集,直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞衰老。目前有少數(shù)研究提示自噬可能參與調(diào)控腎臟衰老。除上述自噬水平低下的情況外,過高的自噬水平(過度自噬)也會造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的嚴(yán)重紊亂,促進(jìn)細(xì)胞的衰老。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)自噬在急性腎損傷、衰老相關(guān)的腎臟疾病、糖尿病腎病和多囊腎等腎臟疾病的病理生理過程中有重要的意義。本團隊在之前的研究中已經(jīng)證實:高糖/AngⅡ誘導(dǎo)可以誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞(Human Glomerular Mesangial Cell,HGMC)衰老,而STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的自噬在在這一過程中發(fā)揮了重要作用。2018年,本團隊進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在人體自然衰老相關(guān)性腎小球硬化的過程中,STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活,并伴有自噬水平的顯著下降,首次在在體人腎組織中證實了上述結(jié)論。STAT5與STAT3同屬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族(Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT),其上游具有一定的重合性,在一些研究中,也發(fā)現(xiàn)STAT3與STAT5可能存在協(xié)同關(guān)系,但各自有具有獨立性。因此,本研究探討STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及自噬在人腎小球系膜細(xì)胞衰老過程中的作用機制。方法:第一部分:收集2015年02月-2017年02月期間,于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科,因泌尿系局限性腫瘤或腎臟外傷行全腎切除術(shù)的患者腎皮質(zhì)組織20例,排除合并彌漫性腎臟病、明顯腎功能不全和/或蛋白尿、合并糖尿病、高血壓、乙型肝炎、血液病、結(jié)締組織病等可能影響腎臟的系統(tǒng)性疾病。入選患者術(shù)前均未接受過放療和化療治療。術(shù)中取材并立即行石蠟包埋或液氮凍存,經(jīng)HE、Masson等常規(guī)病理手段檢測腎小球硬化程度、系膜基質(zhì)及系膜細(xì)胞增殖程度、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色、免疫組化和Western Blot檢測衰老相關(guān)標(biāo)志蛋白P16,綜合上述多種檢測手段,結(jié)合患者自然年齡,綜合評估患者腎臟組織的衰老水平,并將患者分為衰老和年輕兩組。Western Blot檢測腎臟組織中pSTAT5表達(dá)情況,制備腎臟組織石蠟病理切片,免疫組化檢測p-STAT5表達(dá)水平,用于評估兩組間STAT5通路激活水平變化。Western Blot及免疫組化方法檢測人類腎臟標(biāo)本中,自噬相關(guān)蛋白LC3水平,用于評估兩組間自噬水平的變化。通過上述篩查,初步發(fā)現(xiàn)在腎臟衰老過程中STAT5通路和自噬水平的變化,為第二部分研究提出假設(shè)。第二部分:體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞,以250mg/L終末糖基化產(chǎn)物(Advanced Glycation End products,AGEs)或等體積牛血清白蛋白(Bovine Serum Album,BSA)分別刺激體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞(Human Glomerular Mesangial Cells,HGMC)細(xì)胞12、24、48、72小時,Western Blot檢測衰老相關(guān)蛋白、β半乳糖苷酶原位染色,觀察比較各組細(xì)胞衰老水平,建立并驗證人腎小球系膜細(xì)胞衰老模型,獲得AGEs誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞衰老的最佳條件。250mg/L AGE刺激細(xì)胞72小時建立衰老組,等量BSA刺激細(xì)胞建立對照組,shRNA特異性沉默STAT5再以AGEs刺激72小時建立shRNA組,AGEs與1ug/ul氯沙坦共同刺激細(xì)胞72小時,建立氯沙坦組。同上方法檢測各組衰老水平;Western Blot檢測各組終末糖基化產(chǎn)物受體(Receptor of Advanced Glycation End products,RAGE)和pSTAT5水平,評估各組的RAGE-STAT5通路激活水平;Western Blot檢測各組衰老相關(guān)蛋白LC3、透射電鏡觀察各組自噬性空泡數(shù)量、LC3-GFP-mRFP自噬熒光雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染上述各組細(xì)胞,熒光共聚焦顯微鏡觀察并計數(shù)每個細(xì)胞中自噬光斑數(shù)量,綜合上述各檢測方法評估各組自噬水平。比較各組RAGE-STAT5水平、衰老水平和自噬水平,分析STAT5及其調(diào)控的自噬在人腎小球系膜細(xì)胞衰老過程中的作用和機制。再以AGEs和自噬的特異性抑制劑3-MA刺激細(xì)胞,比較兩組的RAGE-STAT5水平、衰老水平、自噬水平,進(jìn)一步確認(rèn)STAT5對衰老的調(diào)控作用是用過調(diào)控自噬實現(xiàn)的。第三部分:40只健康雄性SD大鼠隨機分為3組。第一組10只雄性SD大鼠正常飼養(yǎng)6個月后處死取材,建立年輕對照組。第二組15只雄性SD大鼠正常飼養(yǎng)6個月后,不予其他干預(yù),繼續(xù)正常飼養(yǎng)至20月齡后處死取材,建立衰老組。第三組15只雄性SD大鼠正常飼養(yǎng)6個月后,予氯沙坦30mg/kg/d灌喂,飼養(yǎng)至20月齡處死取材,建立氯沙坦組。培養(yǎng)過程中死亡的大鼠不予取材,出現(xiàn)嚴(yán)重的疾病時予以人道毀滅且不予取材。各組均有10只SD大鼠最終成功取材。大鼠予生理鹽水心臟灌流后,分離獲取全腎標(biāo)本,再于冰上切割分離獲得腎皮質(zhì),石蠟包埋或立即深低溫保存。Western Blot方法和免疫組化方法檢測各組pSTAT5水平,Western Blot檢測各組RAGE、STAT5水平,分析各組的RAGE-STAT5通路水平;Western檢測各組LC3、p16,評估各組衰老和自噬水平。比較各組RAGE-STAT5和衰老、自噬水平,在體驗證第一、第二部分所得的結(jié)論。實驗結(jié)果:第一部分:老年組腎皮質(zhì)中腎小球硬化程度較年輕組顯著升高,衰老相關(guān)蛋白P16水平也顯著提升。但是自然年齡與p16的Western Blot檢測IOD水平、腎小球Masoon染色所示硬化水平均無線性相關(guān)性。石蠟切片經(jīng)免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),老年組LC3水平較青年組顯著降低(p0.0001),提示老年組腎臟組織中自噬水平降低。組織蛋白提取物經(jīng)Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),老年組RAGE和pSTAT5水平較年輕組具有顯著升高(p
【圖文】：

4 實驗結(jié)果4.1 衰老腎臟組織的認(rèn)定 在本研究團隊之前的研究中已經(jīng)證明，，腎小球硬化率與人類的自然年齡存在線性相關(guān)關(guān)系。在衰老相關(guān)的研究中，“老年”的年齡分界一直存在爭議。Melk 等在相關(guān)研究中曾以>50 歲的患者認(rèn)定為“老年”[10]，而近年也有研究將這一標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定為 60 歲[12]或 65 歲[13]。依據(jù) WHO 對老年人的定義，本實驗中我們以年齡>65 歲作為分組標(biāo)準(zhǔn)。為確證保兩組腎臟標(biāo)本存在自然年齡和生物學(xué)意義上的衰老，本實驗以 Masson 染色鑒定老年組腎臟存在病理水平上的顯著硬化，同時以衰老相關(guān)蛋白p16 水平證實腎臟標(biāo)本存在衰老相關(guān)蛋白表達(dá)改變。Masson 染色檢測老年組和年輕組患者腎皮質(zhì)中腎小球硬化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年組腎小球硬化程度較年輕組顯著增高。

提取年輕組和老年組腎皮質(zhì)蛋白，Western Blot 檢測各組衰老相關(guān)蛋白 p16 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老年組 p16 水平較年輕組顯著提高（p < 0.001）。4.2 RAGE pSTAT5 通路在老年組腎臟中表達(dá)水平升高 Western Blot 法檢測年輕組和老年組 RAGE 的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAGE 水平在老年人腎臟中表達(dá)顯著增高（p < 0.05）。圖 1 2 Western Blot 檢測年輕組和老年組腎臟 p16 水平 A：20 例患者 p16 水平對比 B：IOD 水平分析 *** p < 0.001
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R692

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本文編號：2616050