發(fā)布時間：2020-04-06 02:19

【摘要】：背景:局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerular sclerosis,FSGS)是一種常見的腎病,常與蛋白尿和漸進(jìn)性腎功能衰竭有關(guān),其特征為足細(xì)胞損傷,腎小球毛細(xì)血管袢的缺失和塌陷。然而,FSGS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,近年來分子遺傳學(xué)的進(jìn)展提供了越來越多的證據(jù)表明足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能紊亂成為FSGS發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。在本研究中,通過對一例FSGS患者行基因測序,找出致病基因并驗(yàn)證其致病機(jī)制。方法:采用新一代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)篩出與FSGS致病相關(guān)基因,之后進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證,最后篩出致病基因。后提取先證者全血行RNA-PCR驗(yàn)證,檢測致病基因mRNA表達(dá)水平,并通過免疫組織化學(xué)驗(yàn)證其表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)中,利用siRNA敲除足細(xì)胞中的候選致病基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。通過流式細(xì)胞及凋亡蛋白caspase3的免疫印記檢測驗(yàn)證細(xì)胞凋亡情況,查閱文獻(xiàn)可知細(xì)胞凋亡與線粒體功能障礙有關(guān),之后通過mitosox檢測線粒體ROS生成及檢測線粒體結(jié)構(gòu)蛋白F-actin的表達(dá)及排列驗(yàn)證線粒體功能紊亂。結(jié)果:通過NGS和Sanger測序驗(yàn)證篩選出可能的致病基因-COQ6。該基因(NM_182480)的第一外顯子exonl存在無義突變.;c.G41A:p.W14X,第41位密碼子的UGG變?yōu)閁GA(色氨酸變?yōu)榻K止密碼子)。先證者全血RNA的PCR檢測及免疫組化結(jié)果均顯示COQ6表達(dá)明顯下降。體外實(shí)驗(yàn)中,RNAi抑制COQ6表達(dá)后,通過Annexin V/FITC結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測到凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,同時凋亡相關(guān)蛋白活性Capase-3的表達(dá)明顯增加。此時線粒體產(chǎn)生的ROS顯著增加(MitoSOX信號增強(qiáng)),結(jié)構(gòu)蛋白F-actin排列紊亂。結(jié)論:COQ6的突變將影響線粒體的呼吸鏈功能,從而產(chǎn)生過多的ROS,導(dǎo)致足細(xì)胞骨架紊亂而誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,這可能是該患者出現(xiàn)FSGS的可能機(jī)制。為今后的FSGS的篩查提供基本的理論依據(jù)。
【圖文】：

１：先證者腎臟病理圖，病理示ＦＳＧＳ。Ａ：光鏡下腎組織ＰＡＳ染色（２００Ｘ）邋；邋Ｂ：織ＰＡＭ染色（２００Ｘ）邋；邋Ｃ：電鏡下示足細(xì)胞足突融合及消失。逡逑先證者及其父親既往無蛋白尿或血尿的病史。其母親曾于我院行腎活檢：。此，證母的晨外周脈血

病變患者（對照組）的腎組織中進(jìn)行了⑶Ｑ６、ＣＵＢＮ和ＡＰ０Ｌ１的免疫組織化學(xué)染色實(shí)逡逑驗(yàn)。免疫組化結(jié)果顯示，先證者及其母親的⑶Ｑ６和⑶ＢＮ表達(dá)水平均顯著低于對照組逡逑（圖２）。然而，先證者ＡＰ０Ｌ１表達(dá)明顯高于對照組（圖２），，這與文獻(xiàn)［８］報(bào)道相矛盾，逡逑所以，ＡＰ０Ｌ１的致病可能被排除。由于⑶ＢＮ主要表達(dá)在腎小管［９］，而ＦＳＧＳ主要是逡逑腎小球病變，其特征是足細(xì)胞足突的缺失，因此ＣＵＢＮ的致病可能亦被排除，從而確逡逑認(rèn)Ｃ０Ｑ６突變的致病作用。逡逑ＣＯＱ６逡逑４／；；：邋■＊邋＾．１－逡逑Ｖ邐．邋ｒ．邐；：？邐■逡逑＃求’域Ｕ．．逡逑ｃ＿逡逑ＣＯＮ邐Ｐ邐Ｍ逡逑圖２：邋Ｃ０Ｑ６，邋ＣＵＢＮ及ＡＰ０Ｌ１在腎臟組織的免疫組化結(jié)果。（Ｘ４００）逡逑ＣＯＮ：對照組，病理為微小病變；Ｐ：先證者，病理為ＦＳＧＳ；邋Ｍ：先證者母親，病理為ＦＳＧＳ。逡逑３．邐Ｃ０Ｑ６－ｍＲＮＡ在先證者全血中表達(dá)下降逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692.6

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本文編號：2615863