【摘要】：【背景】膀胱癌通過兩種不同的途徑發(fā)展,導致非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)。這兩種亞型具有獨特的病理特征和不同的分子特征。大約60%NMIBC經(jīng)尿道電切術治療后會復發(fā),且20-30%會進展為MIBC。而MIBC患者預后差,并且30年來總體生存率沒有變化。癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)由美國政府發(fā)起。這項關于腫瘤的基因特征研究不僅提供了可能作為治療靶點的基因驅(qū)動因素的信息,而且還提供了侵襲性疾病亞型或集群的信息。這些群集可能與預后因素和獨特的治療有關,從而提高疾病診斷、治療和預防癌癥的能力,也為進一步研究分析膀胱癌發(fā)病機制、治療靶點和侵襲性疾病亞型或集群信息提供條件。這些可能與預后因素和治療方法有關,并可能最終向個體化患者管理邁出一步。為此,本研究依據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析了膀胱癌差異表達基因并進行驗證以及生物學功能研究。【目的】通過TCGA數(shù)據(jù)庫轉錄組數(shù)據(jù)生物信息學分析篩選膀胱癌與正常尿路上皮差異表達基因,并進行驗證,研究其生物學功能�！静牧吓c方法】1.運用TCGA數(shù)據(jù)庫下載RNASeqV2(n=433)矯正數(shù)據(jù)文件,篩選膀胱癌差異表達基因,進行差異基因集分析(gene set variation analysis,GSVA)、差異基因富集分析,篩選候選基因SOX17。2.配對的膀胱癌組織及正常尿路上皮組織(n=40)提取RNA并進行qRT-PCR,驗證SOX17在膀胱腫瘤組織及正常尿路上皮中mRNA差異表達3.聯(lián)合公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫和臨床樣本膀胱癌石蠟切片(包括膀胱癌石蠟切片(n=150)和正常尿路上皮組織石蠟切片(n=50)),探索SOX17基因表達量與膀胱癌的病理分期和膀胱患者預后的關系。4.檢測正常尿路上皮細胞系和膀胱癌細胞系SOX17基因mRNA和編碼蛋白表達量。5.瞬轉干擾RNA(siRNA)方法對SOX17基因高表達細胞系BIU-87行基因干擾,通過質(zhì)粒轉染對SOX17基因低表達細胞系UMUC-3進行基因過表達。通過CCK-8實驗檢測SOX17基因敲減對細胞系BIU-87細胞增殖能力影響,SOX17基因過表達對細胞系UMUC-3細胞增殖能力影響。6.細胞劃痕實和Transwell遷移實驗探索SOX17基因干擾對膀胱癌細胞遷移能力的影響;SOX17基因過表達分別對膀胱癌細胞遷移能力的影響。7.Transwell小室細胞侵襲實驗探索SOX17基因干擾和過表達分別對膀胱癌細胞侵襲能力的影響�！窘Y果】1.RNASeqV2(n=433)矯正數(shù)據(jù)文件分析得到膀胱癌全轉錄組基因表達量與正常尿路上皮組織表達量差異倍數(shù)矩陣。篩選條件如下:(1)差異表達倍數(shù)log_2foldchange(log_2FC)"g2;(2)偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)0.01;SOX17基因表達量在正常尿路上皮中顯著高于膀胱癌組織,其log_2FC=-2.879,FDR=1.52E-37;文獻檢索分析證實膀胱癌有關研究中無SOX17基因報道。2.提取配對的膀胱癌組織和正常尿路上皮組織(n=40)RNA進行qRT-PCR實驗驗證SOX17基因差異表達,其中33例患者膀胱癌組織SOX17表達量低于配對的正常尿路上皮組織。3.TCAG數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SOX17在正常組織中表達量顯著高于膀胱癌組織,膀胱癌組織中Stage III SOX17表達量高于Stage IIIIV。Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),SOX17在正常尿路上皮組織中表達量高于膀胱癌組織,在NMIBC中表達量高于MIBC。4.膀胱癌石蠟切片(n=100)和正常尿路上皮石蠟切片(n=50)SOX17基因免疫組化染色分析證實正常尿路上皮SOX17表達量高于NMIBC,NMIBC中SOX17基因表達量高于MIBC。膀胱癌患者中SOX17高表達患者總體生存率明顯高于SOX17低表達患者。5.CCK-8細胞增殖實驗表明,siRNA干擾SOX17基因表達膀胱癌細胞BIU-87增殖能力無顯著變化。質(zhì)粒轉染過表達SOX17基因膀胱癌細胞UMUC-3增殖能力明顯弱于陰性對照組。6.劃痕實驗證實,siRNA干擾SOX17基因表達膀胱癌細胞BIU-87遷移能力無顯著變化,質(zhì)粒過表達SOX17基因膀胱癌細胞UMUC-3遷移能力相較于陰性對照組明顯減弱。Transwell實驗證實siRNA干擾SOX17基因表達膀胱癌細胞BIU-87遷移能力無顯著變化,質(zhì)粒過表達SOX17基因膀胱癌細胞UMUC-3遷移能力相較于陰性對照組明顯減弱。7.Transwell小室細胞侵襲實驗證實siRNA干擾SOX17基因表達膀胱癌細胞BIU-87侵襲能力無顯著變化,質(zhì)粒過表達SOX17基因膀胱癌細胞UMUC-3侵襲能力相較于陰性對照組明顯減弱�！窘Y論】SOX17在正常尿路上皮組織中表達量高于膀胱癌組織,在NMIBC表達量高于MIBC,與膀胱癌病理分期相關。SOX17低表達與預后不良相關。SOX17與膀胱癌生物學功能相關,SOX17過表達顯著抑制膀胱癌細胞系UMUC-3增殖、侵襲、遷移,而SOX17干擾對膀胱癌細胞系BIU-87增殖、遷移、侵襲無顯著影響。
【圖文】：

軍醫(yī)大學碩士學位論文（二）結果1.差異表達的分子差異表達基因篩選標準為:1.|log2FC|"g2;2.FDR＜0.01。按照設定的篩選條篩選出 1833 個顯著差異表達基因，其中 992 個基因在膀胱癌組織中較正皮組織中表達上調(diào)，與之相對應，841 個基因顯著下調(diào)。圖 1-1 為 411 例與 19 例正常尿路上皮差異表達基因火山圖。圖 1-2 為 411 例膀胱腫瘤與尿路上皮差異表達基因熱圖。

圖 1-2.411 例膀胱腫瘤與 19 例正常尿路上皮差異表達基因熱圖。篩選標準為 FDR＜0.01，|log2FC|"g2。紅色表示相較于正常尿路上皮細胞在膀胱癌中上調(diào)的基因，黑色表示基因在正常尿路上皮中與膀胱癌中表達相似。綠色表示相較于正常尿路上皮細胞膀胱癌中下調(diào)的基因。2.基因本體分析基因本體（Gene Ontology,GO）作為功能分類體系，由生物過程(biologicalprocess,BP) ， 分 子 功 能 （ molecular function,MF ） 和 細 胞 組 分 (cellularcomponent,CC) BPCC 這三個部分組成。我們對 411 例膀胱腫瘤與 19 例正常尿路上皮組織行 GO 分析。如圖 1-3 示，差異表達基因在 BP、MF、CC 上富集。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14

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