發(fā)布時(shí)間：2020-04-03 13:16

【摘要】：【背景】膀胱癌通過兩種不同的途徑發(fā)展,導(dǎo)致非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)。這兩種亞型具有獨(dú)特的病理特征和不同的分子特征。大約60%NMIBC經(jīng)尿道電切術(shù)治療后會(huì)復(fù)發(fā),且20-30%會(huì)進(jìn)展為MIBC。而MIBC患者預(yù)后差,并且30年來總體生存率沒有變化。癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)由美國政府發(fā)起。這項(xiàng)關(guān)于腫瘤的基因特征研究不僅提供了可能作為治療靶點(diǎn)的基因驅(qū)動(dòng)因素的信息,而且還提供了侵襲性疾病亞型或集群的信息。這些群集可能與預(yù)后因素和獨(dú)特的治療有關(guān),從而提高疾病診斷、治療和預(yù)防癌癥的能力,也為進(jìn)一步研究分析膀胱癌發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)和侵襲性疾病亞型或集群信息提供條件。這些可能與預(yù)后因素和治療方法有關(guān),并可能最終向個(gè)體化患者管理邁出一步。為此,本研究依據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析了膀胱癌差異表達(dá)基因并進(jìn)行驗(yàn)證以及生物學(xué)功能研究�！灸康摹客ㄟ^TCGA數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析篩選膀胱癌與正常尿路上皮差異表達(dá)基因,并進(jìn)行驗(yàn)證,研究其生物學(xué)功能�！静牧吓c方法】1.運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫下載RNASeqV2(n=433)矯正數(shù)據(jù)文件,篩選膀胱癌差異表達(dá)基因,進(jìn)行差異基因集分析(gene set variation analysis,GSVA)、差異基因富集分析,篩選候選基因SOX17。2.配對的膀胱癌組織及正常尿路上皮組織(n=40)提取RNA并進(jìn)行qRT-PCR,驗(yàn)證SOX17在膀胱腫瘤組織及正常尿路上皮中mRNA差異表達(dá)3.聯(lián)合公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫和臨床樣本膀胱癌石蠟切片(包括膀胱癌石蠟切片(n=150)和正常尿路上皮組織石蠟切片(n=50)),探索SOX17基因表達(dá)量與膀胱癌的病理分期和膀胱患者預(yù)后的關(guān)系。4.檢測正常尿路上皮細(xì)胞系和膀胱癌細(xì)胞系SOX17基因mRNA和編碼蛋白表達(dá)量。5.瞬轉(zhuǎn)干擾RNA(siRNA)方法對SOX17基因高表達(dá)細(xì)胞系BIU-87行基因干擾,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對SOX17基因低表達(dá)細(xì)胞系UMUC-3進(jìn)行基因過表達(dá)。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測SOX17基因敲減對細(xì)胞系BIU-87細(xì)胞增殖能力影響,SOX17基因過表達(dá)對細(xì)胞系UMUC-3細(xì)胞增殖能力影響。6.細(xì)胞劃痕實(shí)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)探索SOX17基因干擾對膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響;SOX17基因過表達(dá)分別對膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響。7.Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)探索SOX17基因干擾和過表達(dá)分別對膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響�！窘Y(jié)果】1.RNASeqV2(n=433)矯正數(shù)據(jù)文件分析得到膀胱癌全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)量與正常尿路上皮組織表達(dá)量差異倍數(shù)矩陣。篩選條件如下:(1)差異表達(dá)倍數(shù)log_2foldchange(log_2FC)"g2;(2)偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)0.01;SOX17基因表達(dá)量在正常尿路上皮中顯著高于膀胱癌組織,其log_2FC=-2.879,FDR=1.52E-37;文獻(xiàn)檢索分析證實(shí)膀胱癌有關(guān)研究中無SOX17基因報(bào)道。2.提取配對的膀胱癌組織和正常尿路上皮組織(n=40)RNA進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SOX17基因差異表達(dá),其中33例患者膀胱癌組織SOX17表達(dá)量低于配對的正常尿路上皮組織。3.TCAG數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SOX17在正常組織中表達(dá)量顯著高于膀胱癌組織,膀胱癌組織中Stage III SOX17表達(dá)量高于Stage IIIIV。Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),SOX17在正常尿路上皮組織中表達(dá)量高于膀胱癌組織,在NMIBC中表達(dá)量高于MIBC。4.膀胱癌石蠟切片(n=100)和正常尿路上皮石蠟切片(n=50)SOX17基因免疫組化染色分析證實(shí)正常尿路上皮SOX17表達(dá)量高于NMIBC,NMIBC中SOX17基因表達(dá)量高于MIBC。膀胱癌患者中SOX17高表達(dá)患者總體生存率明顯高于SOX17低表達(dá)患者。5.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明,siRNA干擾SOX17基因表達(dá)膀胱癌細(xì)胞BIU-87增殖能力無顯著變化。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)SOX17基因膀胱癌細(xì)胞UMUC-3增殖能力明顯弱于陰性對照組。6.劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí),siRNA干擾SOX17基因表達(dá)膀胱癌細(xì)胞BIU-87遷移能力無顯著變化,質(zhì)粒過表達(dá)SOX17基因膀胱癌細(xì)胞UMUC-3遷移能力相較于陰性對照組明顯減弱。Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)siRNA干擾SOX17基因表達(dá)膀胱癌細(xì)胞BIU-87遷移能力無顯著變化,質(zhì)粒過表達(dá)SOX17基因膀胱癌細(xì)胞UMUC-3遷移能力相較于陰性對照組明顯減弱。7.Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)siRNA干擾SOX17基因表達(dá)膀胱癌細(xì)胞BIU-87侵襲能力無顯著變化,質(zhì)粒過表達(dá)SOX17基因膀胱癌細(xì)胞UMUC-3侵襲能力相較于陰性對照組明顯減弱�！窘Y(jié)論】SOX17在正常尿路上皮組織中表達(dá)量高于膀胱癌組織,在NMIBC表達(dá)量高于MIBC,與膀胱癌病理分期相關(guān)。SOX17低表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。SOX17與膀胱癌生物學(xué)功能相關(guān),SOX17過表達(dá)顯著抑制膀胱癌細(xì)胞系UMUC-3增殖、侵襲、遷移,而SOX17干擾對膀胱癌細(xì)胞系BIU-87增殖、遷移、侵襲無顯著影響。
【圖文】：

軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文（二）結(jié)果1.差異表達(dá)的分子差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為:1.|log2FC|"g2;2.FDR＜0.01。按照設(shè)定的篩選條篩選出 1833 個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中 992 個(gè)基因在膀胱癌組織中較正皮組織中表達(dá)上調(diào)，與之相對應(yīng)，841 個(gè)基因顯著下調(diào)。圖 1-1 為 411 例與 19 例正常尿路上皮差異表達(dá)基因火山圖。圖 1-2 為 411 例膀胱腫瘤與尿路上皮差異表達(dá)基因熱圖。

圖 1-2.411 例膀胱腫瘤與 19 例正常尿路上皮差異表達(dá)基因熱圖。篩選標(biāo)準(zhǔn)為 FDR＜0.01，|log2FC|"g2。紅色表示相較于正常尿路上皮細(xì)胞在膀胱癌中上調(diào)的基因，黑色表示基因在正常尿路上皮中與膀胱癌中表達(dá)相似。綠色表示相較于正常尿路上皮細(xì)胞膀胱癌中下調(diào)的基因。2.基因本體分析基因本體（Gene Ontology,GO）作為功能分類體系，由生物過程(biologicalprocess,BP) ， 分 子 功 能 （ molecular function,MF ） 和 細(xì) 胞 組 分 (cellularcomponent,CC) BPCC 這三個(gè)部分組成。我們對 411 例膀胱腫瘤與 19 例正常尿路上皮組織行 GO 分析。如圖 1-3 示，差異表達(dá)基因在 BP、MF、CC 上富集。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14

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本文編號：2613418