【摘要】：背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一種自身免疫性疾病,其特征在于產(chǎn)生自身抗體、免疫復(fù)合物并且在身體的不同部位沉積,導(dǎo)致多器官損傷。狼瘡性腎炎(Lupus Nephritis,LN)是SLE最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥。在診斷為SLE的五年內(nèi),50%-70%的患者發(fā)生LN,并且可能導(dǎo)致永久性腎損傷和慢性腎臟病。在LN患者中,足細胞損害很常見,“單純足細胞病”可能作為狼瘡腎炎足細胞損害的一種形式。IV~V型LN患者的足突寬度(Foot Process Width,FPW)均較正常水平有顯著改變,且FPW與蛋白尿水平相關(guān)(r=0.509,P0.001)。抑制足細胞損傷或?qū)⒊蔀長N新的治療靶點,對改善腎臟預(yù)后具有重大意義。自噬通過溶酶體降解細胞質(zhì)內(nèi)容物保持機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。根據(jù)向溶酶體遞送細胞質(zhì)內(nèi)容物的方式,科學(xué)家們已經(jīng)鑒定出三種主要類型的自噬:巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。其中巨自噬是研究的最透徹的。巨自噬(以下稱為自噬)描述了降解過程,形成獨特的雙膜囊泡(自噬體)以隔離細胞質(zhì)的一部分,然后與溶酶體融合以形成自溶酶體并降解內(nèi)部物質(zhì)。近年來,關(guān)于維生素D的研究表明,它在疾病中發(fā)揮的作用不僅是傳統(tǒng)的鈣磷調(diào)節(jié),在腫瘤、自身免疫病和腎臟疾病中,維生素D通過調(diào)節(jié)自噬活動的強度影響疾病的進展,例如肺小細胞肺癌、克羅恩病、慢性腎臟病和糖尿病腎病等疾病中均有報道。中國中部河南省SLE患者維生素D缺乏的患病率調(diào)查顯示,維生素D不足的患病率高達97.52%,特別是34.71%的患者存在嚴(yán)重的維生素D缺乏癥。Petri等人發(fā)現(xiàn)血清活性維生素D水平增加20ng/ml后,尿蛋白水平降低15%。既往有研究證明維生素D對足細胞損傷有保護作用。然而,維生素D是否通過自噬途徑發(fā)揮對LN患者的足細胞保護作用尚未可知。本研究的目的是研究維生素D是否通過自噬途徑在LN腎炎患者血清中純化的自身抗體誘導(dǎo)的足細胞損傷中起保護作用。方法:本研究選取腎組織和永生化人類足細胞作為研究對象。1.人腎組織標(biāo)本的收集:選取LN患者腎組織標(biāo)本25例(III型n=5;IV型n=5;V型n=5;III+V型n=5;IV+V型n=5),腎腫瘤切除術(shù)后患者癌旁2cm以外的健康腎組織7例作為對照,標(biāo)本取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科和泌尿外科。2.患者外周血血清組織的收集:收集確診為狼瘡腎炎的患者血清,離心后分離保存血清,以備提取血清中的自身抗體,標(biāo)本均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院。3.透射電鏡(TEM)觀察狼瘡腎炎(LN)患者腎組織的自噬活動水平。透射電鏡下觀察狼瘡腎炎(LN)患者(III型n=5;IV型n=5;V型n=5;III+V型n=5;IV+V型n=5)腎組織中足細胞、內(nèi)皮細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞中自噬體的個數(shù),計數(shù)并作統(tǒng)計學(xué)分析。4.對狼瘡腎炎(LN)患者24小時尿蛋白、腎臟病理活動性評分與自噬體個數(shù)作相關(guān)分析。5.計數(shù)LN患者的自噬體個數(shù)并測量血清活性維生素D濃度,作相關(guān)分析。6.明確IgG對體外培養(yǎng)的人類足細胞的作用和對自噬程度的影響,并觀察維生素D在損傷中的作用。純化LN患者的血清中的IgG(1.5mg/ml)作用于體外培養(yǎng)的人類足細胞,加入維生素D(100nmol/L)觀察自噬指標(biāo)及足細胞相關(guān)指標(biāo)的變化。在高倍透射電鏡下觀察足細胞,通過蛋白質(zhì)印跡分析和實時定量熒光PCR評估自噬活性,在體外將mRFP-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的人類足細胞中,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并計數(shù)黃色熒光的個數(shù)并作統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:1.在LN患者腎組織中觀察到自噬水平顯著升高(P0.05),在腎臟固有細胞中,足細胞顯示出最高的自噬水平(P0.05)。在LN的不同分型中,V型(n=5)、III+V型(n=5)和IV+V型(n=5)的自噬水平高于III型(n=5)和IV型(n=5)。2.LN患者的自噬體個數(shù)與臨床指標(biāo)24小時尿蛋白呈正相關(guān)、與腎臟病理活動性評分呈負相關(guān)(P0.05)。3.血清維生素D濃度較高的的LN患者腎組織足細胞中自噬水平較低,且患者血清維生素D濃度與腎組織足細胞自噬體個數(shù)呈負相關(guān)(P0.01)。4.在體外培養(yǎng)的人類足細胞觀察到狼瘡性腎炎患者血清提取的IgG處理組較對照組的蛋白LC3B-II和Beclin 1的表達量升高、p62的消耗以及Nephrin表達量的減少,實時定量熒光PCR結(jié)果顯示MAP1LC3B、BECN1基因表達的增多和SQSTM1基因表達的減少,在透射電鏡下觀察到更多的自噬體,并且在IgG組的共聚焦顯微鏡下觀察到更多的自噬相關(guān)蛋白LC3B,這表明自噬的誘導(dǎo)和足細胞的損傷增加。與IgG組相比,在IgG+VD組中觀察到自噬程度降低以及減輕的足細胞損傷。結(jié)論:1.狼瘡性腎炎患者腎組織自噬程度較健康對照高,其中V型、III+V型、IV+V型足細胞顯示出最高的自噬水平。2.狼瘡性腎炎患者血清純化的IgG能夠?qū)е麦w外培養(yǎng)的足細胞損傷及自噬水平升高,維生素D能降低自噬水平和緩解足細胞損傷。3.維生素D在LN患者自身抗體誘導(dǎo)的足細胞損傷中起保護作用,這可能是LN中的一種新型治療靶點。
【圖文】：

慢性化指數(shù) 0(0 4) 1(0 3) 0(0 0) 0(0 1) 1(1 2)自噬體個數(shù)足細胞 59.40±15.50 33.00±3.16 91.40±43.18 86.00±42.07 93.20±39.90系膜細胞 35.60±11.95 23.40±11.15 22.20±5.81 49.40±34.69 53.80±29.80內(nèi)皮細胞 31.60±4.67 17.20±9.12 37.60±16.10 53.60±30.34 53.20±18.019腎小管上皮細胞 40.20±21.46 30.20±10.38 56.20±32.57 43.20±20.54 33.40±14.57

與健康對照（n = 7）相比，LN 患者同一個腎小球中的足細胞、系膜細胞、內(nèi)皮細胞以及近端腎小管上皮細胞在一個銅網(wǎng)（約 7.065 平方毫米）區(qū)域內(nèi)的自噬體數(shù)量不同，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）（圖 3.2-A）。與健康志愿者相比，LN 患者腎臟固有細胞的自噬活動水平更高，其中足細胞自噬程度的增高尤其明顯。在不同類型的增殖型 LN 患者中，我們觀察到足細胞中自噬體數(shù)量的顯著差異（圖 3.2-A, B）。V 型、III + V 型、IV + V 型表現(xiàn)出比其他類型更高的足細胞自噬水平（圖 3.2-C，，P <0.05）。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R593.242

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本文編號：2601422