【摘要】：蛋白質(zhì)糖基化修飾是最復雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在生命過程中發(fā)揮重要的功能。常見的蛋白質(zhì)糖基化修飾包括:N-糖基化、O-GalNAc糖基化和O-GlcNAc糖基化等,其結(jié)構(gòu)多樣,分布廣泛,并以多種方式參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、信號傳導、細胞-細胞間以及宿主-病原體相互作用等基本生物學過程。其異常變化與免疫性疾病、腫瘤、先天性糖缺陷等重要疾病的發(fā)生發(fā)展相關。因此,糖基化作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中的熱點和難點,一直受到廣泛關注。本文研究重點為糖蛋白質(zhì)組學新方法及其在IgA腎病中的應用研究,包括正常人、非新月體和新月體IgA腎病患者血漿IgA1的N-糖鏈與O-糖基化肽段定性定量比較分析,正常人和IgA腎病患者血漿定量O-糖蛋白質(zhì)組學分析,以及基于氮化碳基底的糖肽高效富集新材料的開發(fā)和應用。本論文由四部分組成。第一章:我們概述了蛋白質(zhì)糖基化修飾的基本概念、研究方法和生物學功能,綜述了IgA腎病中的IgA1糖基化的研究現(xiàn)狀、糖基化修飾方法學難點以及基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組研究現(xiàn)狀,包括血漿O-糖蛋白質(zhì)組的研究現(xiàn)狀、糖蛋白或糖肽富集技術(shù)的研究現(xiàn)狀。第二章:IgA腎病(IgAN)是世界范圍內(nèi)常見的原發(fā)性腎小球疾病,以腎小球系膜區(qū)IgA1沉積和持續(xù)發(fā)炎為典型免疫病理特征,新月體IgA腎病是其中最嚴重的一型。以前的研究表明IgAN患者血漿中的IgA1的糖修飾會發(fā)生異常,但是沒有區(qū)分單體和多聚體IgA1的糖基化,也沒有對糖鏈和糖肽豐度變化進行系統(tǒng)性研究。為此,我們建立了簡單快速且重復性好的單體IgA1(mIgA1)和多聚體IgA1(p IgA1)樣品制備方法和生物質(zhì)譜糖修飾系統(tǒng)性分析方法,并對12例正常人、11例非新月體IgAN患者以及11例新月體IgAN患者血漿中的mIgA1和p IgA1的N-糖鏈以及完整O-糖基化肽段進行了定性定量比較分析,發(fā)現(xiàn)mIgA1和pIgA1的糖基化修飾(如高甘露糖型)存在差異,在健康人、非新月體和新月體IgAN患者血漿mIgA1中發(fā)現(xiàn)了4條N-糖鏈和13條完整O-糖基化肽段表達具有顯著差異(P0.01),在健康人、非新月體和新月體IgAN患者血漿pIgA1中發(fā)現(xiàn)4條N-糖鏈和17條完整O-糖基化肽段表達具有顯著差異(P0.01)。這些差異顯著的糖鏈和糖肽可能作為潛在的疾病診斷標志物或者治療靶標,并為IgA腎病的分型和發(fā)病機制解釋提供依據(jù)。第三章:O-糖基化蛋白質(zhì)組的表達變化與人類疾病如癌癥、炎癥和退行性疾病等相關。為了發(fā)現(xiàn)IgAN患者血漿中異常表達的O-糖蛋白/肽段,并作為潛在生物標記物用于IgA腎病的分型和診斷,我們進行了位點特異性O-糖蛋白質(zhì)組學研究。但是由于O-糖基化修飾的微觀不均一性和宏觀不均一性,人血漿中的位點特異性O-糖基化分析仍然具有挑戰(zhàn)性。為此,我們發(fā)展了一個系統(tǒng)性分析策略,該策略結(jié)合多酶酶切、多維分離的樣品制備、高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜鑒定以及Byonic軟件分析,可以實現(xiàn)對完整的O-糖肽進行表征。結(jié)果表明,多酶酶切或多維分離可以使樣品制備更加有效,EThcD碎裂模式不僅適用于單位點修飾的O-糖基化肽段(50.3%)的鑒定,而且還適用于二重(21.2%)和三重(28.5%)位點修飾的O-糖基化肽段的鑒定。使用嚴格的打分標準,在人血漿中鑒定出源于49個O-糖蛋白的499條非冗余完整O-糖肽,173個O-糖基化位點和6種O-糖鏈,其中包括121個新的O-糖基化位點。這是目前人血漿樣品的位點特異性O-糖蛋白組的最大數(shù)據(jù)集。這項研究開發(fā)的策略有助于深入分析人血漿中的O-糖蛋白,為了解蛋白質(zhì)O-糖基化在人類健康和疾病(IgA腎病)中的功能奠定基礎。此外,還建立了基于雙甲基標記的定量O-糖蛋白度質(zhì)組學方法,并應用于IgA腎病血漿O-糖蛋白組研究,發(fā)現(xiàn)了差異的O-糖基化蛋白和肽段,可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關,是潛在的生物標志物。第四章:糖肽在蛋白質(zhì)中化學計量很低,從復雜生物樣品中直接檢測糖肽十分困難,因而,糖肽富集是深度覆蓋糖蛋白組的關鍵步驟。商業(yè)化糖肽富集材料HILIC特異性和富集效率并不足夠高,因而需要開發(fā)一種高特異性和高富集效率的糖肽富集材料。在本章中,我們制備了一種新的自組裝親水苯硼酸功能化的薄層C_3N_4材料(MPBA-Au@s-C_3N_4,MASC),該材料可基于B-N之間的協(xié)同效應來增強對糖肽的親和力,進而實現(xiàn)對糖肽的有效富集。采用XPS光譜、Zeta電位測試和茜素紅S(ARS)顯色反應對該材料進行了表征,證明了B-N鍵的存在。采用標準蛋白IgG以及辣根過氧化物酶(HRP)對該材料的性能進行了評價,表明該材料對糖肽的富集具有優(yōu)越的性能,包括低pH適應、親水性、穩(wěn)定性、重復性和可循環(huán)利用性、高選擇性(1:100)、低檢測限(0.33 fmol/μL)、高富集效率(~80%)和高回收率(~90%)。該材料也被成功地分別應用于從標準蛋白和復雜樣品中無偏性地捕獲糖肽,鑒定了來自IgG的37條糖肽和HRP的21條糖肽。該材料用于人尿糖肽的富集,分別從女性和男性尿液樣品中鑒定出來自839個糖蛋白的1465條糖肽和來自884個糖蛋白的1553條糖肽。還從5μL的人血漿中鑒定到209種糖蛋白的463條糖肽。證明新型材料MASC可有效富集人血液和尿液中的糖肽,有可能應用于IgA腎病等疾病糖肽標志物的篩選研究,在蛋白質(zhì)糖基化研究領域有良好的應用價值。
【圖文】：

軍事科學院博士學位論文14]。在腫瘤細胞中，O-GalNAc 糖基化會異常改變，產(chǎn)生截短型 O-糖，Tn 抗原），開發(fā)靶向這些 O-糖鏈的疫苗，為癌癥治療提供了新的思路cNAc 糖基化與多種翻譯后修飾如磷酸化之間存在相互作用[16, 17]，共的活性與功能，作為壓力感受器和營養(yǎng)感受器發(fā)揮重要作用[18, 19]。和癌組織中發(fā)現(xiàn) OGT 上調(diào)，OGA 下調(diào)，，導致 O-GlcNAc 糖基化修飾水升[20, 21]。

包括含量最多的單體 IgA1（mIgA1），少量的多聚體（pIgA1）。IgA1 的結(jié)構(gòu)如圖1.2 所示[34]，其含有兩條重鏈和輕鏈，在重鏈 Cα1 和 Cα2 之間存在一個由 19 個氨基酸組成的鉸鏈區(qū)（HR），該鉸鏈區(qū)富含 Ser、Thr 和 Pro，存在 9 個潛在的O-糖基化位點，通常 3~6 個位點同時被單/雙唾液酸核心 1 結(jié)構(gòu)或 Tn 抗原所修飾[35]。在重鏈 Cα2 和 Cα3 上各自存在一個 N-糖基化位點，分別是 Asn263 和Asn459[36]。在人類免疫球蛋白中，絕大多數(shù)都會發(fā)生 N-糖基化，但是目前只發(fā)現(xiàn) IgA1、IgG3 和 IgD 的鉸鏈區(qū)會發(fā)生 O-糖基化[37, 38]。在 IgAN 小鼠模型（β4Gal9-Ⅰ缺陷小鼠）中
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R692.31

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本文編號：2597955