發(fā)布時間：2020-03-24 05:49

【摘要】：研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)作為常見的有機溶劑廣泛應用于工業(yè)環(huán)境,接觸TCE的工人出現(xiàn)以嚴重的全身性皮膚損害為主并伴有肝腎等多器官功能障礙,被命名為“職業(yè)性TCE藥疹樣皮炎”(Occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,ODMLT)。早期研究認為ODMLT是由抗原特異性T淋巴細胞介導的遲發(fā)型超敏反應,但近來研究發(fā)現(xiàn),遲發(fā)型超敏反應不能完全解釋由TCE導致的多臟器損傷。腎功能障礙是ODMLT病人多器官功能衰竭致死的主要原因之一。動物實驗和ODMLT患者研究發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)的功能失調(diào)在TCE致敏引起的腎損傷中發(fā)揮著重要作用。課題組研究中發(fā)現(xiàn),TCE暴露導致激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system,KKS)激活,主要包括緩激肽(Bradykinin,BK)和激肽受體(B1R/B2R)水平的上調(diào)。然而,BK及其受體如何誘導免疫性腎損傷的病理機制尚不清楚。相關(guān)研究證明,B1R和B2R的表達活化參與了成骨細胞、成纖維細胞和結(jié)腸上皮細胞中NF-κB信號通路的激活。NF-κB信號通路在炎癥和免疫反應中起著至關(guān)重要的作用,BK受體也可能通過激活NF-κB信號通路進一步加重TCE誘導的腎臟免疫性損傷。因此,本研究通過阻斷BK與受體(B1R/B2R)結(jié)合來探索TCE致敏小鼠B1R/B2R受體與免疫腎損傷之間的相關(guān)性,從而為選擇靶向藥物進行有效的臨床治療提供新思路。研究目的本研究擬從整體動物實驗到體外細胞實驗兩個層次來探索TCE介導免疫性腎損傷的作用機制。首先,通過整體動物模型觀察BALB/c小鼠經(jīng)TCE致敏后腎臟組織損傷B1R/B2R受體表達和NF-κB信號通路激活以及炎性因子水平表達情況,觀察通過B1R/B2R受體拮抗劑干預處理后其對TCE致敏小鼠腎損傷的改變情況;再者,通過體外實驗提取BALB/c小鼠腎小管上皮細胞進一步驗證TCE介導免疫性腎損傷的作用機制。研究方法1.體內(nèi)實驗在適宜溫度(20~25℃)和濕度(50±5%)的條件下飼養(yǎng)健康的無特定病原體級(specific pathogen-free,SPF)的雌性BALB/c小鼠(6~8周齡,18~24g),12小時光照/黑暗循環(huán)。所有小鼠自由進食飲水,適應性喂養(yǎng)1周(5只/籠)后,將小鼠隨機分配到空白對照組,溶劑對照組,TCE處理組,TCE+B1R拮抗劑處理組或TCE+B2R拮抗劑處理組。構(gòu)建TCE致敏的BALB/c小鼠模型,所有動物均在末次激發(fā)后24小時對皮膚過敏反應進行評分。在B1R/B2R拮抗劑處理組中,TCE激發(fā)前BALB/c小鼠在第17天和第19天腹膜內(nèi)注射R715/HOE140進行干預。2.體外實驗我們成功建立有效提取腎小管上皮細胞(Renal tubular epithelial cell,RETC)的方法來評價TCE致敏小鼠RETC的損傷。通過經(jīng)腹主動脈穿刺用1mg/mlⅡ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶再灌注消化小鼠腎臟后,可獲得較純的腎小管節(jié)段,經(jīng)過培養(yǎng)后腎小管上皮細胞爬出,采用免疫組織化學法和免疫熒光法標記角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)抗體鑒定該方法提取細胞主要為腎小管上皮細胞。結(jié)果1.致敏率和腎臟臟器系數(shù)在最終激發(fā)后24h進行評分,TCE組中的致敏率為44.3%(31/70),B1R拮抗劑預處理組的致敏率為40.5%(15/37),而B2R拮抗劑預處理組的致敏率為34.0%(18/53)�？傊旅袈蕿�40.0%�？瞻讓φ战M和溶劑對照組小鼠皮膚均未見紅斑水腫的現(xiàn)象。小鼠的腎臟臟器系數(shù)比較發(fā)現(xiàn):TCE處理24h后的小鼠腎臟臟器系數(shù)沒有明顯上升。72h TCE致敏組和B1R拮抗劑組的腎臟臟器系數(shù)要明顯高于溶劑對照組,而72h B2R拮抗劑組小鼠腎臟臟器系數(shù)較TCE致敏組和B1R拮抗劑組明顯降低。2.腎臟病理及腎功能改變腎臟組織病理檢測發(fā)現(xiàn)空白對照組和溶劑對照組以及TCE未致組小鼠的腎臟組織中沒有明顯的病理改變,而72h TCE致敏組小鼠腎小管上皮細胞腫脹,近端小管上皮細胞刷狀緣萎縮脫落甚至細胞壞死。比較發(fā)現(xiàn),兩個拮抗劑組小鼠的腎小管上皮細胞病理損傷顯著減輕。腎功能檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),各指標在溶劑對照和空白對照組之間沒有顯著差異,72h陽性致敏組各指標較24h各組有顯著升高。除血清BUN之外,Cr水平在兩個拮抗劑預處理組中均有顯著降低。血清微球蛋白?_1MG和?_2MG變化與Cr趨勢一致,然而,B1RA沒有顯著降低血清?_1MG水平。3.腎臟組織中B1R和B2R表達情況免疫熒光通過CK18雙標檢測發(fā)現(xiàn)B1R和B2R主要在TCE致敏BALB/c小鼠腎臟的腎小管上皮細胞中表達。與空白對照組和溶劑對照組相比,72h TCE致敏組小鼠腎臟中腎小管上皮細胞中B1R和B2R表達顯著增加,而TCE未致敏組的小鼠腎臟中的兩個受體表達均沒有明顯增多。4.免疫組化法檢測Kim-1,Lipocalin-2和NF-?B p65的沉積免疫組織化學分析法檢測腎小管上皮細胞中標志性蛋白Kim-1和Lipocalin-2表達情況評估腎小管損傷。空白對照組和溶劑對照組小鼠的腎臟中沒有明顯可見的Kim-1和Lipocalin-2沉積,而72hTCE致敏組小鼠的這兩種腎小管損傷標志性蛋白的表達顯著增高,且兩個拮抗劑組的表達均顯著低于TCE致敏組。NF-?B p65在腎臟組織表達的結(jié)果表明,腎小管上皮細胞的NF-?B p65細胞核轉(zhuǎn)位在72hTCE致敏組中表現(xiàn)最為顯著,且兩個拮抗劑組的表達均顯著下降。各未致敏組中表達也沒有顯著差異。5.TCE誘導小鼠腎臟的NF-?B p65信號通路活化與溶劑對照組小鼠相比,TCE致敏組小鼠腎臟胞漿蛋白中p-I?B水平顯增加且I?B顯著降低,此外,腎臟組織的細胞核蛋白中,NF-?B p65亞基的水平顯著升高。B1RA和B2RA預處理減弱TCE誘導的I?B磷酸化導致I?B水平的降低以及NF-?B p65亞基的核轉(zhuǎn)位。并且,NF-?Bp65亞基的核轉(zhuǎn)位在兩個拮抗劑組之間差異有統(tǒng)計學意義。6.腎臟NF-?B p65及炎癥因子mRNA水平空白對照組和溶劑對照組之間NF-?Bp65 mRNA表達的差異無統(tǒng)計學意義。與溶劑對照組相比,72h TCE致敏組及B1RA和B2RA致敏組的NF-?B p65mRNA表達水平明顯升高。B1RA和B2RA致敏組與TCE致敏組相比,均顯著抑制了NF-?B p65mRNA表達水平的增高。此外,兩個拮抗劑致敏組之間相比較,NF-?B p65 mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異。B1RA/B2RA干預有效地下調(diào)il-1β,tnf-α和il-17 mRNA的表達水平,且B1RA和B2RA兩個拮抗劑組之間存在顯著差異。此外,與24h時點B2RA預處理小鼠的il-1βmRNA水平,相比TCE致敏組有顯著下降。7.成功建立酶液灌注法提取小鼠腎小管上皮細胞經(jīng)腹主動脈用1mg/mlⅡ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶再灌注消化小鼠腎臟后獲得較純的腎小管節(jié)段并培養(yǎng)。并通過免疫組化法和免疫熒光法標記CK18抗體鑒定,證實該實驗方法所提取細胞主要為腎小管上皮細胞。8.腎小管上皮細胞Megalin表達情況免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)Megalin主要在小鼠腎臟的腎小管上皮細胞中表達。與空白對照組和溶劑對照組相比,72h TCE致敏組小鼠腎小管上皮細胞中Megalin表達顯著減少,TCE未致敏組的細胞中的Melain表達沒有顯著減少。9.小鼠腎小管上皮細胞b1r和b2r mRNA表達TCE致敏小鼠的腎小管上皮細胞b1r和b2r mRNA的表達在空白對照組和溶劑對照組之間差異沒有統(tǒng)計學意義,在72h TCE致敏組腎小管上皮細胞中顯著上升,而TCE未致敏組則有明顯的下降趨勢。10.小鼠腎小管上皮細胞NF-?B信號通路活化TCE陽性處理組與溶劑對照組相比,腎小管上皮細胞p-I?B明顯升高且I?B明顯下降,同時,細胞核蛋白NF-?B p65明顯升高。B1RA和B2RA顯著抑制了p-I?B水平的增高和I?B水平的下降以及細胞核蛋白NF-?B p65的轉(zhuǎn)位。兩個拮抗劑處理組相比,只有p-I?B水平的差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論1.致敏劑量的TCE通過皮膚接觸可致小鼠發(fā)生以皮膚損害為主并伴有腎臟病理和功能損傷的免疫毒性作用。2.TCE致敏的小鼠免疫性腎損傷中伴有KKS的活化,主要是B1R和B2R的表達增高,并通過活化NF-?B信號通路擴大炎癥因子譜進一步加重TCE介導的免疫性腎損傷發(fā)病過程。3.通過成功建立提取腎小管上皮細胞的方法,再次檢測細胞成分的基因水平和蛋白水平變化情況,驗證TCE致敏的小鼠B1R和B2R活化NF-?B信號通路在免疫性腎損傷中發(fā)揮著重要作用。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學博士學位論文胞因子表達，而這些細胞因子可介導腎小管上皮細胞損傷[36, 37]。核因clear factor-ΚB，NF-κB）是 Rel 轉(zhuǎn)錄因子的家族成員之一，由 RelA/p65,l, p50（NF-κB1）, and p52（NF-κB2）5 個成員組成，其中 P50 和 P65 兩為重要，通常形成 P65-P50 異源二聚體以及 P50-P50 同源二聚體兩種形

緩激肽受體激活腎小管上皮細胞 NF-κB 通路介導三氯乙烯免疫性腎損傷假說示意圖ctivation of Bradykin Receptor induces TCE-mediated immune renal tububy upregulation of NF-κB所述，我們推測 TCE 致免疫性腎損傷過程中，，KKS 活化產(chǎn)物 BB2R/B1R 結(jié)合激活腎小管上皮細胞的 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導通路，改變子水平介導腎小管上皮細胞損傷，并且可能通過再次擴大補體系免疫和體液免疫效應，進一步加重免疫性損傷過程。為此，本物實驗并結(jié)合體外實驗，首先觀察 TCE 致敏小鼠 BK/DBK R 結(jié)合激活腎小管上皮細胞 NF-κB 通路炎性細胞因子水平改變情采取分離培養(yǎng) TCE 致敏小鼠腎小管上皮細胞，觀察使用 B2R腎小管上皮細胞 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導通路活化改變情況。最后，
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R692

【參考文獻】

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本文編號：2597897