【摘要】：研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)作為常見的有機(jī)溶劑廣泛應(yīng)用于工業(yè)環(huán)境,接觸TCE的工人出現(xiàn)以嚴(yán)重的全身性皮膚損害為主并伴有肝腎等多器官功能障礙,被命名為“職業(yè)性TCE藥疹樣皮炎”(Occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,ODMLT)。早期研究認(rèn)為ODMLT是由抗原特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng),但近來研究發(fā)現(xiàn),遲發(fā)型超敏反應(yīng)不能完全解釋由TCE導(dǎo)致的多臟器損傷。腎功能障礙是ODMLT病人多器官功能衰竭致死的主要原因之一。動物實(shí)驗(yàn)和ODMLT患者研究發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)的功能失調(diào)在TCE致敏引起的腎損傷中發(fā)揮著重要作用。課題組研究中發(fā)現(xiàn),TCE暴露導(dǎo)致激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system,KKS)激活,主要包括緩激肽(Bradykinin,BK)和激肽受體(B1R/B2R)水平的上調(diào)。然而,BK及其受體如何誘導(dǎo)免疫性腎損傷的病理機(jī)制尚不清楚。相關(guān)研究證明,B1R和B2R的表達(dá)活化參與了成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和結(jié)腸上皮細(xì)胞中NF-κB信號通路的激活。NF-κB信號通路在炎癥和免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用,BK受體也可能通過激活NF-κB信號通路進(jìn)一步加重TCE誘導(dǎo)的腎臟免疫性損傷。因此,本研究通過阻斷BK與受體(B1R/B2R)結(jié)合來探索TCE致敏小鼠B1R/B2R受體與免疫腎損傷之間的相關(guān)性,從而為選擇靶向藥物進(jìn)行有效的臨床治療提供新思路。研究目的本研究擬從整體動物實(shí)驗(yàn)到體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩個層次來探索TCE介導(dǎo)免疫性腎損傷的作用機(jī)制。首先,通過整體動物模型觀察BALB/c小鼠經(jīng)TCE致敏后腎臟組織損傷B1R/B2R受體表達(dá)和NF-κB信號通路激活以及炎性因子水平表達(dá)情況,觀察通過B1R/B2R受體拮抗劑干預(yù)處理后其對TCE致敏小鼠腎損傷的改變情況;再者,通過體外實(shí)驗(yàn)提取BALB/c小鼠腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證TCE介導(dǎo)免疫性腎損傷的作用機(jī)制。研究方法1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在適宜溫度(20~25℃)和濕度(50±5%)的條件下飼養(yǎng)健康的無特定病原體級(specific pathogen-free,SPF)的雌性BALB/c小鼠(6~8周齡,18~24g),12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)。所有小鼠自由進(jìn)食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(5只/籠)后,將小鼠隨機(jī)分配到空白對照組,溶劑對照組,TCE處理組,TCE+B1R拮抗劑處理組或TCE+B2R拮抗劑處理組。構(gòu)建TCE致敏的BALB/c小鼠模型,所有動物均在末次激發(fā)后24小時(shí)對皮膚過敏反應(yīng)進(jìn)行評分。在B1R/B2R拮抗劑處理組中,TCE激發(fā)前BALB/c小鼠在第17天和第19天腹膜內(nèi)注射R715/HOE140進(jìn)行干預(yù)。2.體外實(shí)驗(yàn)我們成功建立有效提取腎小管上皮細(xì)胞(Renal tubular epithelial cell,RETC)的方法來評價(jià)TCE致敏小鼠RETC的損傷。通過經(jīng)腹主動脈穿刺用1mg/mlⅡ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶再灌注消化小鼠腎臟后,可獲得較純的腎小管節(jié)段,經(jīng)過培養(yǎng)后腎小管上皮細(xì)胞爬出,采用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法標(biāo)記角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)抗體鑒定該方法提取細(xì)胞主要為腎小管上皮細(xì)胞。結(jié)果1.致敏率和腎臟臟器系數(shù)在最終激發(fā)后24h進(jìn)行評分,TCE組中的致敏率為44.3%(31/70),B1R拮抗劑預(yù)處理組的致敏率為40.5%(15/37),而B2R拮抗劑預(yù)處理組的致敏率為34.0%(18/53)�？傊旅袈蕿�40.0%�？瞻讓φ战M和溶劑對照組小鼠皮膚均未見紅斑水腫的現(xiàn)象。小鼠的腎臟臟器系數(shù)比較發(fā)現(xiàn):TCE處理24h后的小鼠腎臟臟器系數(shù)沒有明顯上升。72h TCE致敏組和B1R拮抗劑組的腎臟臟器系數(shù)要明顯高于溶劑對照組,而72h B2R拮抗劑組小鼠腎臟臟器系數(shù)較TCE致敏組和B1R拮抗劑組明顯降低。2.腎臟病理及腎功能改變腎臟組織病理檢測發(fā)現(xiàn)空白對照組和溶劑對照組以及TCE未致組小鼠的腎臟組織中沒有明顯的病理改變,而72h TCE致敏組小鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹,近端小管上皮細(xì)胞刷狀緣萎縮脫落甚至細(xì)胞壞死。比較發(fā)現(xiàn),兩個拮抗劑組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞病理損傷顯著減輕。腎功能檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),各指標(biāo)在溶劑對照和空白對照組之間沒有顯著差異,72h陽性致敏組各指標(biāo)較24h各組有顯著升高。除血清BUN之外,Cr水平在兩個拮抗劑預(yù)處理組中均有顯著降低。血清微球蛋白?_1MG和?_2MG變化與Cr趨勢一致,然而,B1RA沒有顯著降低血清?_1MG水平。3.腎臟組織中B1R和B2R表達(dá)情況免疫熒光通過CK18雙標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)B1R和B2R主要在TCE致敏BALB/c小鼠腎臟的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)。與空白對照組和溶劑對照組相比,72h TCE致敏組小鼠腎臟中腎小管上皮細(xì)胞中B1R和B2R表達(dá)顯著增加,而TCE未致敏組的小鼠腎臟中的兩個受體表達(dá)均沒有明顯增多。4.免疫組化法檢測Kim-1,Lipocalin-2和NF-?B p65的沉積免疫組織化學(xué)分析法檢測腎小管上皮細(xì)胞中標(biāo)志性蛋白Kim-1和Lipocalin-2表達(dá)情況評估腎小管損傷�？瞻讓φ战M和溶劑對照組小鼠的腎臟中沒有明顯可見的Kim-1和Lipocalin-2沉積,而72hTCE致敏組小鼠的這兩種腎小管損傷標(biāo)志性蛋白的表達(dá)顯著增高,且兩個拮抗劑組的表達(dá)均顯著低于TCE致敏組。NF-?B p65在腎臟組織表達(dá)的結(jié)果表明,腎小管上皮細(xì)胞的NF-?B p65細(xì)胞核轉(zhuǎn)位在72hTCE致敏組中表現(xiàn)最為顯著,且兩個拮抗劑組的表達(dá)均顯著下降。各未致敏組中表達(dá)也沒有顯著差異。5.TCE誘導(dǎo)小鼠腎臟的NF-?B p65信號通路活化與溶劑對照組小鼠相比,TCE致敏組小鼠腎臟胞漿蛋白中p-I?B水平顯增加且I?B顯著降低,此外,腎臟組織的細(xì)胞核蛋白中,NF-?B p65亞基的水平顯著升高。B1RA和B2RA預(yù)處理減弱TCE誘導(dǎo)的I?B磷酸化導(dǎo)致I?B水平的降低以及NF-?B p65亞基的核轉(zhuǎn)位。并且,NF-?Bp65亞基的核轉(zhuǎn)位在兩個拮抗劑組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.腎臟NF-?B p65及炎癥因子mRNA水平空白對照組和溶劑對照組之間NF-?Bp65 mRNA表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與溶劑對照組相比,72h TCE致敏組及B1RA和B2RA致敏組的NF-?B p65mRNA表達(dá)水平明顯升高。B1RA和B2RA致敏組與TCE致敏組相比,均顯著抑制了NF-?B p65mRNA表達(dá)水平的增高。此外,兩個拮抗劑致敏組之間相比較,NF-?B p65 mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B1RA/B2RA干預(yù)有效地下調(diào)il-1β,tnf-α和il-17 mRNA的表達(dá)水平,且B1RA和B2RA兩個拮抗劑組之間存在顯著差異。此外,與24h時(shí)點(diǎn)B2RA預(yù)處理小鼠的il-1βmRNA水平,相比TCE致敏組有顯著下降。7.成功建立酶液灌注法提取小鼠腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)腹主動脈用1mg/mlⅡ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶再灌注消化小鼠腎臟后獲得較純的腎小管節(jié)段并培養(yǎng)。并通過免疫組化法和免疫熒光法標(biāo)記CK18抗體鑒定,證實(shí)該實(shí)驗(yàn)方法所提取細(xì)胞主要為腎小管上皮細(xì)胞。8.腎小管上皮細(xì)胞Megalin表達(dá)情況免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)Megalin主要在小鼠腎臟的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)。與空白對照組和溶劑對照組相比,72h TCE致敏組小鼠腎小管上皮細(xì)胞中Megalin表達(dá)顯著減少,TCE未致敏組的細(xì)胞中的Melain表達(dá)沒有顯著減少。9.小鼠腎小管上皮細(xì)胞b1r和b2r mRNA表達(dá)TCE致敏小鼠的腎小管上皮細(xì)胞b1r和b2r mRNA的表達(dá)在空白對照組和溶劑對照組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在72h TCE致敏組腎小管上皮細(xì)胞中顯著上升,而TCE未致敏組則有明顯的下降趨勢。10.小鼠腎小管上皮細(xì)胞NF-?B信號通路活化TCE陽性處理組與溶劑對照組相比,腎小管上皮細(xì)胞p-I?B明顯升高且I?B明顯下降,同時(shí),細(xì)胞核蛋白NF-?B p65明顯升高。B1RA和B2RA顯著抑制了p-I?B水平的增高和I?B水平的下降以及細(xì)胞核蛋白NF-?B p65的轉(zhuǎn)位。兩個拮抗劑處理組相比,只有p-I?B水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.致敏劑量的TCE通過皮膚接觸可致小鼠發(fā)生以皮膚損害為主并伴有腎臟病理和功能損傷的免疫毒性作用。2.TCE致敏的小鼠免疫性腎損傷中伴有KKS的活化,主要是B1R和B2R的表達(dá)增高,并通過活化NF-?B信號通路擴(kuò)大炎癥因子譜進(jìn)一步加重TCE介導(dǎo)的免疫性腎損傷發(fā)病過程。3.通過成功建立提取腎小管上皮細(xì)胞的方法,再次檢測細(xì)胞成分的基因水平和蛋白水平變化情況,驗(yàn)證TCE致敏的小鼠B1R和B2R活化NF-?B信號通路在免疫性腎損傷中發(fā)揮著重要作用。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文胞因子表達(dá)，而這些細(xì)胞因子可介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷[36, 37]。核因clear factor-ΚB，NF-κB）是 Rel 轉(zhuǎn)錄因子的家族成員之一，由 RelA/p65,l, p50（NF-κB1）, and p52（NF-κB2）5 個成員組成，其中 P50 和 P65 兩為重要，通常形成 P65-P50 異源二聚體以及 P50-P50 同源二聚體兩種形

緩激肽受體激活腎小管上皮細(xì)胞 NF-κB 通路介導(dǎo)三氯乙烯免疫性腎損傷假說示意圖ctivation of Bradykin Receptor induces TCE-mediated immune renal tububy upregulation of NF-κB所述，我們推測 TCE 致免疫性腎損傷過程中，，KKS 活化產(chǎn)物 BB2R/B1R 結(jié)合激活腎小管上皮細(xì)胞的 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改變子水平介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷，并且可能通過再次擴(kuò)大補(bǔ)體系免疫和體液免疫效應(yīng)，進(jìn)一步加重免疫性損傷過程。為此，本物實(shí)驗(yàn)并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，首先觀察 TCE 致敏小鼠 BK/DBK R 結(jié)合激活腎小管上皮細(xì)胞 NF-κB 通路炎性細(xì)胞因子水平改變情采取分離培養(yǎng) TCE 致敏小鼠腎小管上皮細(xì)胞，觀察使用 B2R腎小管上皮細(xì)胞 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化改變情況。最后，
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2597897