【摘要】：研究背景腎纖維化是幾乎所有不同病因的進(jìn)展性慢性腎病(CKD)的共同病理特征。腎小管上皮細(xì)胞的EMT過(guò)程被認(rèn)為是導(dǎo)致腎纖維化過(guò)程中的一環(huán)。ROS與CKD進(jìn)展中纖維化的機(jī)制有關(guān),能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT以及促炎細(xì)胞因子IL-1β的產(chǎn)生。因此,過(guò)量的ROS被越來(lái)越多地認(rèn)為是造成腎臟氧化應(yīng)激損傷和促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT、炎癥發(fā)展的一個(gè)重要因子。腎臟ROS的主要來(lái)源是NADPH氧化酶(Nox)生成。那么,抑制腎小管上皮細(xì)胞中Nox來(lái)源的ROS生成可能是防治腎纖維化的突破口。NADPH氧化酶4(Nox4)最初在腎臟中被發(fā)現(xiàn)并被鑒定為Nox的一種亞型,在腎臟中高表達(dá)。Nox由5個(gè)亞基組成:催化亞基gp91phox、跨膜亞基p22phox,胞漿亞基p47phox、p67phox和小GTP酶結(jié)合蛋白R(shí)ac1等組裝成多亞基氧化酶復(fù)合體。Rac可能是Nox1,Nox2,Nox4,Nox5的催化劑。但目前對(duì)于Rac1在Nox4激活過(guò)程中的角色存在爭(zhēng)議。小GTP結(jié)合蛋白解離刺激因子(SmgGDS)是一種能將小GTP結(jié)合蛋白從GDP結(jié)合形式變成GTP結(jié)合的形式的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子。SmgGDS通過(guò)結(jié)合到Rac1的核定位信號(hào)序列,促進(jìn)Rac1的核轉(zhuǎn)位及蛋白酶體系統(tǒng)降解,以達(dá)到抑制Rac1的效果�；赗ac1在Nox家族活化過(guò)程中所起的作用,在SmgGDS的調(diào)節(jié)下,Rac1作為NADPH氧化酶生成ROS過(guò)程中一個(gè)環(huán)節(jié),可能成為我們防治ROS產(chǎn)生腎損傷的新的治療靶點(diǎn)。研究方法一、SmgGDS低表達(dá)HK-2細(xì)胞載體構(gòu)建:接種HK-2細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)板中,轉(zhuǎn)染3種siRNA-SmgGDS后,提取總RNA、總蛋白,qRCR和Western blot檢驗(yàn)SmgGDS的mRNA、蛋白表達(dá)水平。二、ROS的測(cè)定:接種HK-2細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)板中,轉(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS后,加入50μM、100μM的NADPH氧化酶抑制劑Apocynin或Rac1抑制劑NSC23766預(yù)處理30min或者4h,熒光染色后用熒光倒置顯微鏡拍照采集熒光照片。三、Rac1、Nox4的蛋白、mRNA表達(dá)水平測(cè)定:轉(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS 36H后,加入50μM的NSC23766預(yù)處理36H,提取總蛋白,Westemblot檢驗(yàn)Rac1、Nox4的蛋白表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS 24H后,加入50μM的NSC23766預(yù)處理24H,提取總RNA,qRCR檢驗(yàn)Nox4的mRNA表達(dá)水平。四、下游cα-SMA、E-cadherin及IL-1β的mRNA水平測(cè)定:轉(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS 24H后,加入50μM、1OOμM的NSC23766預(yù)處理24h,qRCR檢驗(yàn)E-cadherin、a-SMA、IL-1β的mRNA水平。五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:以上實(shí)驗(yàn)均在同樣條件下重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組均數(shù)因素間比較時(shí)采用單因素方差分析(ANOVA)。P0.05時(shí)差異被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、SmgGDS低表達(dá)HK-2細(xì)胞載體構(gòu)建成功:三條siRNA-SmgGDS中的SmgGDS mRNA、蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯的下降。提示SmgGDS低表達(dá)HK-2細(xì)胞載體構(gòu)建成功。二、SmgGDS低表達(dá)HK-2細(xì)胞誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生并被Apocynin和NSC23766抑制:轉(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS后的HK-2細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS,細(xì)胞ROS生成比較陰性對(duì)照組明顯增高。轉(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS后,加入50μM、1OOμM的Apocynin或者NSC23766作用于HK-2細(xì)胞。Apocynin和NSC23766都降低了ROS的生成。并且隨著Apocynin和NSC23766濃度的升高,ROS生成逐漸減少,呈濃度依賴性。該部分研究結(jié)果表明,Rac1及NADPH氧化酶在SmgGDS誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS的機(jī)制中有著重要的作用。三、SmgGDS在HK-2細(xì)胞中通過(guò)Rac1調(diào)控Nox4的表達(dá):對(duì)比對(duì)照組,細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS后,Rac1蛋白水平和Nox4的mRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯的增加。而50μM的NSC23766能降低因?yàn)檗D(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS導(dǎo)致的Rac1、Nox4的蛋白水平升高和Nox4的mRNA水平升高。這些數(shù)據(jù)表明在HK-2細(xì)胞中SmgGDS可能通過(guò)Rac1來(lái)調(diào)節(jié)Nox4的表達(dá)。四、SmgGDS-Rac1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT和炎癥因子表達(dá):轉(zhuǎn)染siRNA-SmmgGDS后,α-SMA、IL-1βmRNA表達(dá)水平的增加,E-cadherinmRNA表達(dá)下降。并且使用50μM、100μM的NSC23766可以抑制因轉(zhuǎn)染siRNA-SmgGDS升高的IL-1β的mRNA水平,抑制程度呈濃度依賴性。使用50μM的NSC23766可以逆轉(zhuǎn)干擾SmgGDS所引起的α-SMA增加和E-cadherin下降。證明SmgGDS-Rac1通路在HK-2細(xì)胞的EMT和炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。結(jié)論抑制SmgGDS的表達(dá)可以通過(guò)Rac1上調(diào)Nox4的表達(dá),從而生成大量的ROS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT和炎癥因子表達(dá)。
【圖文】：

ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ邋組與邋ｓｉＲＮＡ－ＮＣ邋相比干擾效率分別為邋８５．２３％、６７．３５％、７４．５１％。逡逑三條ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ中的ＳｍｇＧＤＳ邋ｍＲＮＡ表達(dá)水平與ＳｉＲＮＡ－ＮＣ組相比均明逡逑顯的下降（？？＜0．０５，圖１－Ａ）。進(jìn)一步Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與ｑＰＣＲ逡逑結(jié)果一致，經(jīng)過(guò)ｓｉＲＮＡｌ，ｓｉＲＮＡ２和ｓｉＲＮＡ３轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞的ＳｍｇＧＤＳ蛋逡逑白表達(dá)受到明顯的抑制，ＳｍｇＧＤＳ蛋白在ｓｉＲＮＡｌ，邋ｓｉＲＮＡ２，邋ｓｉＲＮＡ３和陰性對(duì)逡逑照組邋ｓｉＲＮＡ－ＮＣ邋的相對(duì)表達(dá)量分別為邋０．２９７±０．０９１，０．３７６±０．１００，０．３５９±０．１５５，逡逑０．６５４±０．２０６，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ＰＣ０．０５，圖邋１－Ｂ）。說(shuō)明邋ｓｉＲＮＡｌ，邋ｓｉＲＮＡ２逡逑和ｓｉＲＮＡ３均為有效轉(zhuǎn)染序列，能在人腎小管上皮細(xì)胞中有效沉默ＳｍｇＧＤＳ的逡逑ｍＲＮＡ及蛋白表達(dá)，提示ＳｍｇＧＤＳ低表達(dá)人腎小管上皮細(xì)胞載體構(gòu)建成功。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑＜邋１．５－逡逑筆逡逑１．０－邋：逡逑？邐ＳｍａＧＤＳ邐前ｉｌｍｔｌｉｌｐ逡逑｜邐匕邋Ｌ—邋邐———逡逑ｉ邋０．５－邐＊逡逑ｇ邐＊邐ｇａｄｐｈ邋ｍｍｍ邋ｍｍｍ邋■ｗｉｉｂｉｍｗｉ邋ｍｍｍｍ逡逑屬。。１＾１邐ｓｉＲＮＡｌ邋ｓｉＲＮＡ２邋ｓｉＲＮＡ３邋ｓｉＲＮＡ－ＮＣ逡逑Ｃ邋１０１逡逑卜邐Ｔ逡逑Ｓ邋０．６－邐＊逡逑ｌ：：ｌｉ邋ｉｌｌ逡逑圖１：轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ后

照組細(xì)胞ＲＯＳ生成很少且熒光強(qiáng)度比較弱。而轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ后的腎小逡逑管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ＲＯＳ，細(xì)胞ＲＯＳ生成比較陰性對(duì)照組明顯增高（尸＜逡逑０．０５，圖２、３）。證明ＳｍｇＧＤＳ低表達(dá)時(shí)對(duì)ＲＯＳ的誘導(dǎo)作用。為了判斷ＲＯＳ逡逑的產(chǎn)生來(lái)源，細(xì)胞轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ后，我們加入ＮＡＤＰＨ氧化酶抑制劑逡逑Ａｐｏｃｙｎｉｎ邋５０ｐＭ、１（％Ｍ作用于腎小管上皮細(xì)胞。對(duì)比轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ組，逡逑Ａｐｏｃｙｎｉｎ降低了邋ＲＯＳ的生成（／？＜０．０５）。并且隨著Ａｐｏｃｙｎｉｎ濃度的升高，ＲＯＳ逡逑生成逐漸減少，呈濃度依賴性（Ｐ＜０．０５）。結(jié)果如下圖２所示。這說(shuō)明ＳｍｇＧＤＳ逡逑低表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生的ＲＯＳ來(lái)源于ＮＡＤＰＨ氧化酶。結(jié)合Ｒａｃｌ在ＮＡＤＰＨ氧化酶逡逑家族所起的活化作用，出于驗(yàn)證Ｒａｃｌ是否參與其中的目的，我們進(jìn)一步加入逡逑Ｒａｃｌ抑制劑ＮＳＣ２３７６６邋５０ｐＭ、１００ｐＭ預(yù)處理轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ的細(xì)胞。結(jié)逡逑果發(fā)現(xiàn)，ＮＳＣ２３７６６處理后的細(xì)胞ＲＯＳ的產(chǎn)生被抑制，且隨著ＮＳＣ２３７６６濃度逡逑的升高，其減輕ＲＯＳ產(chǎn)生的能力增強(qiáng)，，呈濃度依賴性（Ｐ＜０．０５，圖３）。該部逡逑分研究結(jié)果表明
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：2595214