【摘要】：背景:睪丸癌(Testicular cancer,TC)是15-34歲年輕男性最常見的惡性腫瘤,其5年生存率超過95%,目前認(rèn)為睪丸癌屬于“可治愈”的惡性腫瘤疾病。睪丸腫瘤分為生殖細(xì)胞腫瘤和非生殖細(xì)胞腫瘤,其中以生殖細(xì)胞腫瘤(germ cell tumor/GCT)居多,超過95%。睪丸腫瘤的發(fā)病原因尚不清楚,其危險因素包括:隱睪或睪丸未降(睪丸發(fā)育不全綜合征),Klinefelter綜合征等,家族遺傳因素,對側(cè)睪丸腫瘤和不孕不育。近年來的研究發(fā)現(xiàn),B-cell lymphoma 2 ovarian killer(BOK)作為一種促凋亡蛋白,在惡性腫瘤中起腫瘤抑制作用。截至目前,有關(guān)BOK蛋白在睪丸癌中的研究文獻(xiàn)報道較少,其具體生物學(xué)作用目前仍不清楚。目的:本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)及蛋白質(zhì)印跡的方法來檢測BOK蛋白在10例睪丸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況,通過BOK過表達(dá)及敲低的方法進(jìn)一步研究其有關(guān)生物學(xué)行為及可能的機制。研究方法:1、本研究收集2014年至2016年期間于上海長征醫(yī)院泌尿外科行外科手術(shù)切除,經(jīng)病理專家證實為睪丸癌及相應(yīng)癌旁組織10例,標(biāo)本通過固定包埋,HE染色后經(jīng)病理醫(yī)師明確診斷。2、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測BOK抗體在睪丸癌組織及對應(yīng)癌旁組織中蛋白表達(dá)情況。3、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:兩個TC細(xì)胞系(TCam-2和I-10)和正常睪丸Hs1.Tes購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素鈉、100 mg/ml鏈霉素的DMEM和F-12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到50-70%匯合時,使用DNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。4、Western blot分析:使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。印跡膜與1:500稀釋的BOK抗體或胱天蛋白酶-3/裂解的半胱天冬酶-3抗體一起溫育。洗滌后,將膜與辣根過氧化物酶連接的山羊抗兔1:2000稀釋液一起溫育。使用Eas ySee Western印跡試劑盒進(jìn)行測定。5、CCK8分析:轉(zhuǎn)染后24小時將細(xì)胞消化,計數(shù),接種于96孔板中,培養(yǎng)0,12,24,36和48小時,最后使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒進(jìn)行評估。6、Transwell侵襲實驗:具有人工基底膜的8-μm孔徑的通透性隔離腔用于體外侵襲實驗。細(xì)胞被消化并計數(shù)。將100μl共1×10~5個細(xì)胞鋪于上部室中,并將500μL補充有10%FBS的培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘物覆蓋于底部室上。4%多聚甲醛固定底部上的非遷移細(xì)胞,并用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。在顯微鏡下以×400放大倍數(shù)計數(shù)細(xì)胞。7、TUNEL檢測:將TCam-2和I-10細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)24小時,用冷P BS洗滌并用4%多聚甲醛固定。使用一步法TUNEL凋亡測定試劑盒進(jìn)行測定。細(xì)胞核中的凋亡細(xì)胞顯示綠色熒光。8、統(tǒng)計分析:用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。假設(shè)雙側(cè)獨立方差,采用雙側(cè)t檢驗和方差分析對各組間的平均值進(jìn)行統(tǒng)計。P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1、與癌旁組織相比,BOK主要在正常細(xì)胞中表達(dá),并且在睪丸癌組織中顯著下調(diào)。通過RT-PCR和Western blot分別驗證了BOK mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果一致(p0.001)。2、BOK過表達(dá)抑制TC細(xì)胞增殖和侵襲,BOK敲低促進(jìn)TC細(xì)胞增殖和侵襲。首先用Western blot檢測了兩個TC細(xì)胞系和正常睪丸細(xì)胞中BOK的表達(dá)水平。Western blot證實了BOK過表達(dá)質(zhì)粒的有效性。進(jìn)行CCK8測定和體外侵襲實驗以檢測細(xì)胞增殖和侵襲。結(jié)果顯示BOK過表達(dá)抑制TCam-2和I-10細(xì)胞的增殖和侵襲。在TCam-2和I-10細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA并進(jìn)行Western印跡以證實siRNA的作用。siRNA轉(zhuǎn)染后BOK的表達(dá)顯著降低。BOK敲低后細(xì)胞增殖和侵襲能力增強。這些數(shù)據(jù)支持BOK在TC中起腫瘤抑制的作用。3、BOK過表達(dá)促進(jìn)睪丸癌細(xì)胞凋亡。我們進(jìn)行Western blot檢測caspase-3/裂解的cas pase-3,TUNEL檢測過表達(dá)BOK的TCam-2和I-10細(xì)胞中的DNA裂解。結(jié)果顯示,當(dāng)TCam-2和I-10細(xì)胞過度表達(dá)BOK時,出現(xiàn)裂解的半胱天冬酶-3。BOK過表達(dá)顯著增加TUNEL陽性細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明BOK通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制TC細(xì)胞增殖。結(jié)論:1、與癌旁組織相比,BOK在睪丸癌組織中頻繁下調(diào)。2、BOK過表達(dá)抑制睪丸癌細(xì)胞增殖和侵襲。相反,BOK敲低促進(jìn)睪丸癌細(xì)胞增殖和侵襲。3、BOK過表達(dá)促進(jìn)睪丸癌細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文3 結(jié)果.1 BOK 在睪丸癌細(xì)胞中低表達(dá)考慮到 BOK 在生殖組織中顯示出限制性表達(dá)并且在人類癌癥中經(jīng)常缺失，我過免疫組織化學(xué)染色檢測了 10 個配對的初級 TC 和癌旁組織標(biāo)本中 BOK 的表圖 1A）。結(jié)果表明，與癌旁組織相比，BOK 主要在正常細(xì)胞中表達(dá)，并且在睪組織中顯著下調(diào)。另外，通過 RT-PCR 和 Western blot 分別驗證了 BOK mRNA白的表達(dá)（圖 1C 和 1B）。結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果一致（P<0.001）。

21圖 2：BOK 過表達(dá)抑制 TC 細(xì)胞增殖和侵襲，并且 BOK 敲低促進(jìn) TC 細(xì)胞增殖和侵襲。（A）通過 Western 印跡檢測不同 TC 細(xì)胞中的 BOK 表達(dá)。（B）通過 Western來檢測 OE-BOK 和 siRNA-BOK 的表達(dá)。（C）通過 CCK8 檢測 BOK 過表達(dá)或敲低后 TCam-2 和 I-10 細(xì)胞的增殖。（D）通過 Transwell 檢測 BOK 過表達(dá)或敲低后 TCam-和 I-10 細(xì)胞的侵襲(Bar=50 μm)。*P <0.05。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.21

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本文編號：2594133