【摘要】：目的:尿路致病性大腸桿菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是尿道感染(urinary tract infections,UTIs)的主要致病因素,UPEC誘發(fā)的UTIs可以導(dǎo)致膀胱炎,腎盂腎炎和前列腺炎,并且在前列腺癌(prostate cancer,PCa)的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。然而,UPEC促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞毒性壞死因子1(Cytotoxic necrotizing factor 1,CNF1)是UPEC的重要毒素蛋白,它在前列腺癌進(jìn)展中的作用目前尚未報(bào)道。監(jiān)控和治療攜帶cnf1的UPEC菌株,對(duì)于控制前列腺癌進(jìn)展具有重要的臨床意義。本論文擬解決以下三個(gè)問題:1.研究CNF1在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用;2.研究CNF1在體內(nèi)對(duì)前列腺癌的作用;3.探討CNF1對(duì)前列腺癌作用的具體分子機(jī)制。方法:1.利用鎳柱純化UPEC11菌株來源的CNF1蛋白,通過細(xì)胞劃痕、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNF1對(duì)前列腺癌細(xì)胞株在體外運(yùn)動(dòng)的作用。2.篩選穩(wěn)定表達(dá)CNF1活性片段(CNF1c)及熒光素酶的PC3前列腺癌細(xì)胞系,構(gòu)建免疫缺陷鼠的尾靜脈注射模型;并且用CNF1蛋白處理穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的22Rv1-luci細(xì)胞系,構(gòu)建免疫缺陷鼠的前列腺原位注射模型。通過小動(dòng)物活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)移灶,并通過HE染色和免疫組化進(jìn)行驗(yàn)證。3.利用免疫熒光和Western blotting(WB)技術(shù),檢測(cè)CNF1是否可以進(jìn)入PC3細(xì)胞內(nèi),通過Pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNF1對(duì)RhoA、Cdc42和Rac1的活化影響。4.利用RhoA、Cdc42和Rac1的抑制劑以及siRNA分別檢測(cè)它們?cè)贑NF1影響PC3運(yùn)動(dòng)中的作用。進(jìn)一步瞬轉(zhuǎn)野生型、活化型和失活型Cdc42表達(dá)質(zhì)粒,分析Cdc42對(duì)前列腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用。5.利用Cdc42下游效應(yīng)蛋白PAK1的抑制劑檢測(cè)PAK1在CNF1影響PC3運(yùn)動(dòng)中的作用。并利用WB技術(shù),檢測(cè)CNF1處理后,PAK1第423位蘇氨酸的磷酸化水平。進(jìn)一步瞬轉(zhuǎn)野生型、活化型和失活型PAK1表達(dá)質(zhì)粒,分析PAK1對(duì)前列腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用。6.利用WB技術(shù),檢測(cè)CNF1處理PC3和22Rv1細(xì)胞后,MMP2和MMP9的表達(dá)水平。7.利用免疫組化技術(shù),檢測(cè)CNF1c過表達(dá)前列腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)肺部轉(zhuǎn)移灶中MMP9和磷酸化PAK1的表達(dá)水平。8.利用免疫組化技術(shù),檢測(cè)組織芯片中磷酸化PAK1的表達(dá)水平和組織病理分級(jí)的相關(guān)性。9.利用鎳柱純化其它UPEC來源的CNF1蛋白,通過Transwell遷移和侵襲以及WB實(shí)驗(yàn),比較不同UPEC來源的CNF1對(duì)PC3的影響。結(jié)果:1.UPEC11菌株來源的CNF1普遍促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞在體外的遷移和侵襲。2.尾靜脈注射表達(dá)CNF1c PC3細(xì)胞的免疫缺陷鼠肺部轉(zhuǎn)移水平明顯高于對(duì)照組;前列腺原位接種CNF1蛋白處理的22Rv1-luci細(xì)胞的免疫缺陷鼠各組織器官腫瘤轉(zhuǎn)移水平也明顯高于對(duì)照組。CNF1顯著促進(jìn)PC3和22Rv1細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。3.CNF1進(jìn)入PC3細(xì)胞內(nèi)并且活化了RhoA、Cdc42和Rac1,而且CNF1對(duì)Cdc42和Rac1的作用要強(qiáng)于RhoA。4.Cdc42的抑制和敲低明顯減弱了CNF1的促PC3遷移和侵襲能力,Rac1的抑制和敲低則完全沒有影響,而RhoA的抑制和敲低也明顯減弱了對(duì)照組PC3遷移和侵襲的基本能力。瞬轉(zhuǎn)活化型Cdc42促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。5.PAK1抑制劑削弱了CNF1的促PC3遷移和侵襲能力。而且CNF1顯著促進(jìn)了PAK1第423位蘇氨酸的磷酸化水平。瞬轉(zhuǎn)活化型PAK1促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。6.CNF1促進(jìn)了PC3細(xì)胞內(nèi)MMP9的表達(dá)水平,對(duì)MMP2的表達(dá)水平?jīng)]有影響。7.CNF1c表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞在肺部轉(zhuǎn)移灶中MMP9和磷酸化PAK1的表達(dá)水平顯著提高。8.在臨床樣本中,隨著前列腺癌組織學(xué)分級(jí)的升高,磷酸化PAK1的陽性染色百分比和表達(dá)強(qiáng)度也增強(qiáng)。9.CNF1蛋白的不同UPEC菌株來源并不影響它對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用,均通過相同機(jī)制顯著促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。結(jié)論:1.CNF1可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞在體外的遷移和侵襲能力。2.CNF1可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。3.CNF1可以進(jìn)入前列腺癌細(xì)胞內(nèi)并活化RhoA、Cdc42和Rac1。4.CNF1通過活化Cdc42介導(dǎo)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。5.CNF1通過活化Cdc42-PAK1-MMP9信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞在體外的遷移和侵襲能力以及在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。6.磷酸化PAK1的表達(dá)水平和人類惡性前列腺癌病理分級(jí)呈正相關(guān)性。7.不同UPEC來源的CNF1對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有相似的促遷移和促侵襲作用。
【圖文】：

17圖 1.1圖 1.1（A）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) PC3 細(xì)胞經(jīng)透析液、LPS 和不同劑量 CNF1 蛋白處理36 h 后的遷移能力。（B）為對(duì)圖 A 遷移距離的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。（C）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) PC3 細(xì)胞經(jīng) 1 nM CNF1 蛋白、透析液、LPS 處理后不同時(shí)間的遷移能力。（D為對(duì)圖 C 各時(shí)間點(diǎn)遷移距離的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。柱形圖代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示），，**P<0.01,（B, D）為單因素方差分析。1.2.2 純化的 CNF1 蛋白促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞 PC3 在體外的遷移和侵襲能力，并且這一作用對(duì)前列腺癌細(xì)胞有一定的普遍性我們進(jìn)一步用 Transwell 實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證 CNF1 對(duì) PC3 的促遷移作用，在Transwell 的上室和下室溶液中分別加入透析液，LPS 和 1 nM CNF1 蛋白，結(jié)果

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文發(fā)現(xiàn)在遷移實(shí)驗(yàn)和加 Matrigel 的侵襲實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，CNF1 蛋白處理顯促進(jìn)了 PC3 的遷移和侵襲能力（如圖 1.2 A, B）。除了雄激素非依賴的前列癌細(xì)胞株 PC3，其它三株雄激素依賴（LNCaP 和 22Rv1）和雄激素非依賴（VCaP）前列腺癌細(xì)胞系也被 CNF1 蛋白明顯促進(jìn)了遷移和侵襲能力，表CNF1 促前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力具有普遍性（如圖 1.2 C, D）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.25

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1 郭雅秀;CNF1激活Cdc42-PAK1信號(hào)軸促進(jìn)前列腺癌的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2594244