【摘要】：[研究背景]近年來男性不育發(fā)生率快速增加,其中30%患者為病因不明的特發(fā)性不育(如非梗阻性無/寡精子癥和嚴重少精子癥),而且缺乏有效的治療措施。因此,深入研究精子發(fā)生的分子機制對于闡明不育癥的病因具有重要意義。精子發(fā)生過程包括精原細胞有絲分裂、精母細胞減數(shù)分裂和精子的變態(tài)分化及成熟等階段,其受多種激素和眾多基因的共同調(diào)控。減數(shù)分裂(meiosis)是形成單倍體精子細胞的重要環(huán)節(jié),而Rad51是參與減數(shù)分裂重組修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白。由重組酶Rad51和Dmc1催化的單鏈入侵、同源配對及鏈交換是減數(shù)分裂重組中最核心的事件。Meiosis I前期,核酸內(nèi)切酶SPO11催化產(chǎn)生大量的程序性DNA雙鏈斷裂(double-strandedDNAbreaks,DSBs),啟動減數(shù)分裂重組。DSBs形成后形成3'端單鏈DNA(ssDNA)尾;Rad51和Dmcl結(jié)合到ssDNA上形成核蛋白纖維,并介導(dǎo)ssDNA侵入同源雙鏈區(qū)域,形成D-loop中間體。在DSBs產(chǎn)生后,同源染色體開始配對、聯(lián)會,形成聯(lián)會復(fù)合體(synaptonemal complex,SC)。SC既能維持同源染色體的配對,也能作為支架(scaffold)與Rad51和Dmcl結(jié)合,促進重組復(fù)合物形成并參與減數(shù)分裂重組過程。由于全身性敲除Rad51基因的小鼠胚胎期致死,難以利用該動物模型研究Rad51基因在精子發(fā)生過程中的作用機制。條件性基因敲除小鼠模型可以避免全身性基因敲除小鼠可能出現(xiàn)的胚胎致死,但目前尚無Rad51的條件性基因敲除小鼠的報道。為了探究Rad51在雄性小鼠生殖發(fā)育過程中作用及機制探究,我們開展了以下研究工作:1.Rad51在小鼠睪丸中的表達Western blotting方法證明Rad51蛋白在不同日齡小鼠睪丸組織中均有表達,其表達水平從8日齡開始升高,在42日齡時表達水平明顯增加,42日齡與96日齡Rad51蛋白的表達水平無明顯差異。免疫組化和Real-time PCR方法證明Rad51在小鼠睪丸生殖細胞中高表達。2.Rd51條件性敲除小鼠不育我們構(gòu)建了Rad51條件型敲除小鼠,并將其與DDX4-Cre轉(zhuǎn)基因工具小鼠交配,進而得到從胚胎期15天生殖細胞缺失Rad51基因的雄性小鼠。通過Western blotting和免疫組化確定敲除效果,發(fā)現(xiàn)Rad51fl/-;DDX4-Cre雄性小鼠的睪丸體積較對照小鼠減少2/3并出現(xiàn)在小鼠個體發(fā)育早期。生育力實驗表明其不育。3.Rd51條件性敲除小鼠中減數(shù)分裂和精原細胞增殖受阻通過染色體鋪片和睪丸組織切片免疫熒光檢測聯(lián)會復(fù)合體蛋白(SCP-3)和DNA損傷相關(guān)蛋白(γ-H2AX),發(fā)現(xiàn)在Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠中減數(shù)分裂過程受阻。采用免疫熒光和免疫組化對增殖相關(guān)蛋白Ki-67染色檢測生殖細胞增殖,發(fā)現(xiàn)在Rad51f/-;DDX4-Cre小鼠中Ki-67表達受損。接下來我們探索精子發(fā)生早期精原細胞有絲分裂階段PLZF表達情況的分析顯示PLZF不表達,精原細胞有絲分裂過程受阻。4.檢測Rad51條件性敲除小鼠曲細精管中支持細胞因為Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠睪丸曲細精管中只含有一層細胞,且精原細胞有絲分裂過程受阻,通過對支持細胞標(biāo)記物SOX9免疫熒光和免疫組化染色證明了Rad51fl-;DDX4-Cre小鼠睪丸曲細精管中只含有支持細胞,對支持細胞數(shù)目的統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)支持細胞數(shù)目明顯增多;透射電鏡觀察法觀察支持細胞形態(tài)異常,細胞延伸至曲細精管管腔中部,但內(nèi)部的細胞器未發(fā)現(xiàn)異常。5.Rad51fl/;凰DX4-Cre小鼠生殖細胞有較高的DNA損傷并且對X射線敏感性增加Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠和對照組小鼠照射4GyX射線并釋放24小時,檢測γ-H2AX結(jié)果表明與對照小鼠相比,Rad51fl/+;DDX4-Cre小鼠本底有較高的DNA損傷且睪丸組織對X射線更敏感。
【圖文】：

發(fā)生過程是由二倍體的配子經(jīng)過分化發(fā)育為單倍體精子的過程，，在精子發(fā)生中，逡逑二倍體的雄性原始生殖細胞（ＰＧＣ）經(jīng)過有絲分裂、減數(shù)分裂和分化最終形成成逡逑熟精子，該過程受眾多基因和激素的共同調(diào)控，精子發(fā)生過程（圖１）包括原始逡逑生殖細胞（ＰＧＣ）特化、遷移和增殖；性原細胞有絲分裂、靜息和遷移；精原細逡逑胞有絲分裂；精母細胞減數(shù)分裂和成熟精子形成

齡與９６日齡Ｒａｄ５１蛋白的表達水平無明顯差異（如圖３）。逡逑為明確Ｒａｄ５１在小鼠睪丸組織的表達和定位，我們?nèi)∫吧统赡晷凼蟮牟G丸逡逑組織，經(jīng)石蠟包埋、組織切片，進行ＨＥ染色（圖１Ａ）和免疫組化染色（圖１Ｂ），逡逑圖１Ａ中可明顯看出曲細精管中含大量的支持細胞（紅色箭頭）、精原細胞（黃逡逑色箭頭）、精母細胞（黑色箭頭）、精細胞（綠色箭頭），并且Ｒａｄ５１主要在生殖逡逑細胞的細胞核中大量表達（圖１Ｂ）。逡逑以上結(jié)果表明從小鼠出生８天開始，精母細胞開始進入減數(shù)分裂階段，Ｒａｄ５１逡逑在第一波生精減數(shù)分裂的過程中開始大量表達，在第一波生精波（３５天）完成逡逑后Ｒａｄ５１表達量維持在穩(wěn)定的水平。這提示Ｒａｄ５１在精子發(fā)生過程中可能起著逡逑重要的作用。逡逑２９逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R698.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Double-stranded DNA breaks and gene functions in recombination and meiosis[J];Cell Research;2006年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 江小華;支持細胞依賴的結(jié)構(gòu)和功能對小鼠生殖細胞發(fā)育影響的研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2014年

本文編號：2593578