發(fā)布時間：2020-02-13 23:49

【摘要】：背景：前列腺癌是歐美國家男性腫瘤患者死亡的主要原因，近年來，我國前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢。前列腺癌發(fā)生主要與遺傳基因和環(huán)境因素有關(guān)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases，GSTs）作為Ⅱ相解毒酶，可清除體內(nèi)有害物質(zhì)、保護DNA及一些蛋白質(zhì)免受損傷。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（Glutathione S-transferase pi-1，GSTP1)是GSTs中與腫瘤相關(guān)性最密切的成員，GSTP1的異�？赡苁乔傲邢侔┌l(fā)生發(fā)展的重要因素之一。 人體自身不能合成、而只能從食物中攝取的番茄紅素屬異戊二烯類化合物，是抗氧化性最強的類胡蘿卜素。大量流行病學(xué)和初期臨床試驗都證實了服用番茄紅素對前列腺健康有很好的保護作用，不僅能降低患病危險性，還能減緩前列腺癌轉(zhuǎn)移的進程。番茄紅素在前列腺癌的預(yù)防和治療中有著顯著作用，番茄紅素是否通過調(diào)節(jié)前列腺癌發(fā)生中關(guān)鍵的基因異常，如GSTP1的表達和活性而對前列腺發(fā)揮保護作用？這種保護又基于何種分子機制，目前皆不清楚。 本研究分別采用采用不同來源的前列腺癌細胞株作為模型，，探討番茄紅素對前列腺癌GSTP1基因表達的調(diào)控研究，從一個新的分子靶點探尋番茄紅素的抑癌機理，為臨床上前列腺癌的防治研究提供可借鑒的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和新的思路。 第一部分番茄紅素對前列腺癌GSTP1基因表觀調(diào)控機制研究 目的：利用兩株前列腺癌細胞（雄激素依賴LNCaP細胞系、雄激素非依賴PC-3細胞系）作為前列腺癌細胞模型，采用不同濃度番茄紅素處理，從而多角度檢測番茄紅素對前列腺癌細胞的凋亡、增殖，以及相關(guān)基因如II相代謝酶GSTP1基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控影響。 方法： MTS法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和周期；甲基化PCR測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）分析GSTP1啟動子和基因組ALU和LINE-1序列甲基化水平的影響；通過qPCR、Westernblot和免疫熒光分析基因mRNA或蛋白的表達。 結(jié)果：1、5~20μmol/L番茄紅素處理72小時可以分別誘導(dǎo)LNCaP和PC-3細胞凋亡，并通過G1期阻滯抑制細胞增殖。2、10μmol/L番茄紅素處理LNCaP細胞14天降低ALU和LINE-1重復(fù)序列甲基化水平，未顯著降低GSTP1啟動子區(qū)CpG島甲基化水平，GSTP1基因mRNA和蛋白表達無顯著變化。3、10μmol/L番茄紅素處理PC-3細胞14天顯著降低GSTP1啟動子區(qū)CpG島甲基化水平，并上調(diào)GSTP1基因mRNA水平和蛋白水平表達。番茄紅素的去甲基化作用可能是通過抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的表達而引起。番茄紅素對PC-3細胞ALU和LINE-1甲基化水平無顯著影響。 結(jié)論：番茄紅素誘導(dǎo)兩株前列腺癌細胞凋亡和G1期阻滯從而抑制細胞增殖。番茄紅素處理對雄激素非依賴性PC-3細胞GSTP1啟動子區(qū)CpG島去甲基化從而上調(diào)GSTP1的表達，對雄激素非依賴性LNCaP細胞則無去甲基化作用。 第二部分 番茄紅素通過Nrf2/ARE通路誘導(dǎo)GSTP1基因表達的研究 目的：利用前列腺癌DU145細胞作為模型，采用不同濃度番茄紅素處理，從體外細胞實驗探索番茄紅素是否通過Nrf2/ARE通路對GSTP1基因的表達發(fā)揮調(diào)控作用。 方法：雙熒光素酶報告基因檢測番茄紅素對GSTP1啟動子區(qū)順式調(diào)控元件ARE（pARE-luc報告基因質(zhì)粒）的激活能力；利用siRNA-Nrf2抑制DU145細胞轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達后，檢測番茄紅素對pARE-luc報告基因質(zhì)粒的激活能力。通過qPCR和Western blot實驗觀察番茄紅素處理對DU145細胞GSTP1基因的mRNA和蛋白表達水平影響，以及當Nrf2基因過表達和抑制表達時GSTP1表達變化。 結(jié)果：1、10μmol/L和20μmol/L番茄紅素處理DU145細胞72小時顯著提高pARE-luc報告基因啟動子活性，同時上調(diào)GSTP1基因的mRNA和蛋白表達。2、當DU145細胞本底Nrf2的表達被siRNA-Nrf2抑制后，番茄紅素失去了對pARE-luc報告基因的激活能力，同時也抑制了番茄紅素誘導(dǎo)GSTP1基因mRNA和蛋白表達水平升高的能力。3、Nrf2過表達導(dǎo)致DU145細胞中的下游基因GSTP1表達增高。 結(jié)論：番茄紅素在DU145細胞中可以通過Nrf2/ARE通路誘導(dǎo)GSTP1基因的表達，從而發(fā)揮對前列腺健康的保護作用。
【圖文】：

2.1 番茄紅素對前列腺癌細胞增殖能力影響2.1.1 番茄紅素對前列腺癌細胞生存力影響（MTS 法）番茄紅素對前列腺癌細胞生存力的影響，研究分別采用 0, 5, 10, 20, 40μmol/L番茄紅素和 5μmol/L AZA 處理 LNCaP（圖 1.1.A）和 PC-3（圖 1.1.B）細胞 24, 48,72 小時。與 0μmol/L 對照組相比，20、40μmol/L 番茄紅素處理 72 小時，結(jié)果顯示細胞存活率顯著下降(P<0.05) 。然而，10μmol/L 番茄紅素連續(xù) 72 小時處理兩株前列腺癌細胞株都沒有引起明顯的細胞增殖抑制。因此，根據(jù)本實驗 MTS 結(jié)果及番茄紅素能在人體內(nèi)達到的生理濃度結(jié)合考慮[7]，采用 10μmol/L 作為隨后研究中番茄紅素使用濃度。雖然本實驗再一次證實了前人報道的高濃度番茄紅素具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，但與以往報道相比，本研究番茄紅素的抑制細胞增殖作用較弱[8,9]。

細胞凋亡率顯著增加（P<0.05）。本實驗提示番茄紅素能夠誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡，且具有一定的濃度依賴性（圖1.2.I）。LNCap-LY(0μmol)/LLNCap-LY(10μmol)/L LNCaP-LY(20μmol)/LLNCaP-LY(5μmol)/L
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

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5 王s

本文編號：2579293