【摘要】：目的:對(duì)于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌,不論是術(shù)后免疫治療還是局部化療,其高復(fù)發(fā)率和高進(jìn)展率依然是泌尿外科領(lǐng)域難以解決的問(wèn)題,且大多藥物毒副作用十分明顯,使患者承受著巨大的痛苦。如患者條件允許,符合手術(shù)適應(yīng)癥,肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者多數(shù)會(huì)選擇根治性膀胱切除術(shù),術(shù)后予以輔助性全身化療,現(xiàn)應(yīng)用于膀胱癌全身化療的藥物主要是鉑類為主的化療藥物,然而,此類化療藥物因其副作用明顯,耐藥性等問(wèn)題威脅著臨床中肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的治療。因此,能夠?qū)ふ页鲆环N毒副作用小,作用效果明顯且不易產(chǎn)生耐藥或者能夠逆轉(zhuǎn)耐藥的的藥物已迫在眉睫。和厚樸酚是傳統(tǒng)中藥厚樸的提取物,在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其具有良好的抗腫瘤作用,且毒副作用很低,其在膀胱癌中研究也有報(bào)道,但研究尚淺。本研究用不同濃度的和厚樸酚處理膀胱癌細(xì)胞(T24及EJ),觀察和厚樸酚對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制情況,促進(jìn)凋亡及抑制血管生成等生物學(xué)行為的影響,并嘗試探討和厚樸酚抗膀胱癌的作用機(jī)理。方法:體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱癌T24和EJ細(xì)胞,并用不同濃度的和厚樸酚進(jìn)行處理。首先用肉眼觀察不同處理組的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量變化,確認(rèn)有效果后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。MTT和單克隆形成試驗(yàn)觀察細(xì)胞的增殖情況,同時(shí)用MTT法篩選出藥物的最佳處理濃度。用流式細(xì)胞術(shù)檢查和厚樸酚對(duì)T24,EJ細(xì)胞周期和凋亡的影響,用PCR篩選周期,凋亡,增殖及血管生成等相關(guān)蛋白的mRNA的表達(dá)水平,腫瘤細(xì)胞的增殖,凋亡,周期蛋白的表達(dá)情況采用Western blot實(shí)驗(yàn)及Caspase相關(guān)試劑盒檢驗(yàn)并推測(cè)和厚樸酚抗膀胱癌可能的相關(guān)通路。結(jié)果:1、MTT結(jié)果:和厚樸酚處理膀胱癌細(xì)胞T24和EJ細(xì)胞后,兩種腫瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象,且這種現(xiàn)象呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴性。單克隆形成試驗(yàn)表明,和厚樸酚對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞單克隆的形成具有明顯的抑制作用,且此作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。2、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果:用不同濃度的和厚樸酚(0ul,20ul,40 ul,60 ul)處理膀胱癌T24和EJ細(xì)胞48h后,我們發(fā)現(xiàn)隨著和厚樸酚濃度的增高,兩種腫瘤細(xì)胞的周期抑制效果越明顯,并且T24和EJ細(xì)胞大多被抑制在G1期向S期轉(zhuǎn)化(即抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂)。同樣方法處理上述腫瘤細(xì)胞后,隨著和厚樸酚濃度的增高,兩種細(xì)胞的凋亡細(xì)胞所占比例逐漸升高,且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。3、PCR檢測(cè)結(jié)果:搜集不同濃度和厚樸酚處理細(xì)胞的總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后檢測(cè)周期,凋亡,增殖,血管生成等相關(guān)基因在mRNA水平的變化情況,顯示和厚樸酚作用后的腫瘤細(xì)胞中PCNA,CDK-4,CDK-6,BCL-2,MCL-1,VEGF的mRNA水平明顯下降;Bad,Bax,Bak的mRNA表達(dá)量明顯上升。以上結(jié)果顯示,和厚樸酚能夠明顯抑制膀胱癌T24和EJ細(xì)胞的增殖作用(周期抑制),誘導(dǎo)T24和EJ細(xì)胞的凋亡,和抑制腫瘤血管的生成。4、Caspase-3、8、9檢測(cè)結(jié)果:用不同濃度的和厚樸酚(0ul,20ul,40 ul,60 ul)處理膀胱癌T24和EJ細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)隨著和厚樸酚藥物濃度的增加,Caspase-3、8、9的表達(dá)量逐漸增加,這種濃度增加的現(xiàn)象呈現(xiàn)出時(shí)間劑量依賴效應(yīng),表明和厚樸酚誘導(dǎo)膀胱癌T24和EJ細(xì)胞的凋亡。并且這種凋亡呈現(xiàn)出Caspase依賴的途徑。5、Western-blot結(jié)果顯示:和厚樸酚能夠抑制CDK-4,CDK-6,BCL-2蛋白的表達(dá),能夠增強(qiáng)Bax蛋白的表達(dá),且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。結(jié)論:和厚樸酚能夠抑制膀胱癌T24及EJ細(xì)胞的增殖,其抑制增殖的主要機(jī)理是腫瘤細(xì)胞大多被抑制在G1/S期的節(jié)點(diǎn)上,表明和厚樸酚能夠阻止腫瘤細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化,抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂;和厚樸酚能夠通過(guò)誘導(dǎo)Caspase依賴途徑和Caspase非依賴途徑導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞T24及EJ細(xì)胞的凋亡。在者,和厚樸酚不僅通過(guò)內(nèi)源性途徑影響膀胱癌T24及EJ細(xì)胞的凋亡,還通過(guò)外源性途徑影響腫瘤細(xì)胞的凋亡;和厚樸酚能夠抑制膀胱癌T24及EJ細(xì)胞的血管的生成�？傊�,和厚樸酚具有良好的抗膀胱癌腫瘤細(xì)胞的效果,其能夠從多種方面抑制膀胱癌腫瘤細(xì)胞,但仍需深入的去探討相關(guān)的通路以期為臨床的應(yīng)用提供更加充分的理論依據(jù)。
【圖文】：

結(jié)果2.1 MTT 法檢測(cè)不同濃度（0uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkiol 作癌 T24 和 EJ 細(xì)胞后細(xì)胞的增殖情況2.1.1 應(yīng)用不同濃度（0 uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkiol 作癌 T24 細(xì)胞 24、48、72h 后，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)出各組的 OD 值，利用公式活力，結(jié)果顯示各組的細(xì)胞活力表現(xiàn)出明顯差異（p＜0.05），表明 H膀胱癌 T24 細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，這種增殖的抑制效果與量正相關(guān)（如圖 2.1，，表 2.1）。

2.1.2 應(yīng)用不同濃度（0 uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkio癌 EJ 細(xì)胞 24、48、72h 后，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)出各組的 OD 值，利用公式力，結(jié)果顯示各組的細(xì)胞活力表現(xiàn)出明顯差異（p＜0.05），表明 胱癌 EJ 細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，這種增殖的抑制效果與時(shí)相關(guān)（如圖 2.2，表 2.2）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2572576