【摘要】：前列腺癌是西方國(guó)家最為常見(jiàn)的男性惡性腫瘤之一。近年來(lái)，隨著人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅著老年人口的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。前列腺癌的病程進(jìn)展緩慢，早期采用前列腺切除術(shù)可顯著提高治愈率；但當(dāng)晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，一般采用放化療、內(nèi)分泌療法等手段，但治愈率低，10年生存率不足10%，而且易導(dǎo)致其進(jìn)展為激素非依賴型前列腺癌�？傊�，目前對(duì)于晚期、轉(zhuǎn)移及激素非依賴型患者仍然缺乏有效手段，因此，亟需尋找一種新的治療方案。 基因治療能有效針對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已成為提升前列腺癌治療水平的重要力量。目前，已有多項(xiàng)前列腺癌基因治療藥物處于臨床試驗(yàn)階段。溶瘤病毒和免疫基因治療是基因治療的兩大重要方向。溶瘤腺病毒不但能夠在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制并殺傷腫瘤細(xì)胞，而且還能介導(dǎo)治療基因在的高效表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮療效；而免疫基因治療，能夠通過(guò)向腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境導(dǎo)入免疫基因或免疫調(diào)節(jié)基因，激活機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。有研究表明，CD40L與腫瘤抗原融合表達(dá)，可以通過(guò)CD40與CD40L的相互作用，將腫瘤抗原靶向樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cell, DC），進(jìn)一步激活T淋巴細(xì)胞和特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。本課題組前期工作中，集合溶瘤腺病毒與免疫基因治療的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建了攜帶前列腺特異性抗原（Prostate SpecificAntigen，PSA）和CD40L融合蛋白基因（PSA-CD40L，PL）的前列腺癌特異性溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A，并進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。本課題將在以往工作基礎(chǔ)上，系統(tǒng)評(píng)價(jià)Ad-PL-PPT-E1A的體外溶瘤及免疫激活效應(yīng)，，同時(shí)，探討其體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。 首先，在已經(jīng)制備攜帶PL基因的前列腺癌特異性溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A和非溶瘤對(duì)照病毒Ad-PL的基礎(chǔ)上，采用本實(shí)驗(yàn)室建立的以Adeasy系統(tǒng)為基礎(chǔ)的溶瘤腺病毒構(gòu)建體系，構(gòu)建和制備單純?nèi)芰鰧?duì)照病毒Ad-PPT-E1A。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法鑒定病毒基因組，采用蛋白印記（Western-blotting）檢測(cè)目的基因（PL、E1A）的表達(dá)。鑒定正確后，大量擴(kuò)增病毒，采用氯化銫（Caesium Chloride，CsCl）密度梯度離心純化病毒，TCID50法測(cè)定其感染滴度為6×1011IU/ml。 接著，在體外分別對(duì)Ad-PL-PPT-E1A的特異性復(fù)制和溶瘤效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)：（1）5MOI溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A及陽(yáng)性對(duì)照病毒Ad-TPE-CD80-GM感染前列腺癌細(xì)胞PC3、PC3M、DU145、LNCaP，以及對(duì)照細(xì)胞L02、HepG2、Hela后，分別于感染后24h、48h和72h收集細(xì)胞和上清，TCID50測(cè)定病毒活性，結(jié)果顯示，前列腺癌細(xì)胞中病毒活性呈時(shí)間依賴性增加，而在非前列腺癌細(xì)胞中無(wú)明顯改變，表明Ad-PL-PPT-E1A具有前列腺癌特異性的復(fù)制能力；（2）為進(jìn)一步明確病毒復(fù)制的機(jī)制，我們?cè)谇傲邢侔┘?xì)胞中，采用Western-blotting和real-time PCR方法分別檢測(cè)了Ad-PL-PPT-E1A介導(dǎo)的腺病毒復(fù)制必需基因E1A的表達(dá)，結(jié)果顯示，E1A的表達(dá)在前列腺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性的增加，與病毒活性檢測(cè)結(jié)果一致；（3）病毒復(fù)制可造成細(xì)胞裂解和死亡，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-PL-PPT-E1A和單純?nèi)芰鰧?duì)照病毒Ad-PPT-E1A能夠有效殺傷前列腺癌細(xì)胞，并呈時(shí)間和劑量依賴性的增加，而對(duì)照病毒Ad-PL對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響；（4）同時(shí)，結(jié)晶紫檢測(cè)結(jié)果顯示，溶瘤腺病毒具有前列腺癌特異性殺傷效應(yīng)：例如，感染后6d，0.1MOI Ad-PL-PPT-E1A對(duì)激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP的殺傷率可達(dá)99%；10MOI Ad-PL-PPT-E1A對(duì)激素非賴性前列腺癌細(xì)胞PC3M的殺傷率為70%左右，而10MOI的Ad-PL-PPT-E1A其對(duì)正常細(xì)胞及其他類型腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯的殺傷作用。 接下來(lái)，我們對(duì)Ad-PL-PPT-E1A的體外免疫激活效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。（1）溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A感染前列腺癌細(xì)胞后，real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，嵌合免疫基因PL表達(dá)呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性增加；（2）將感染Ad-PL-PPT-E1A的前列腺癌細(xì)胞裂解液，與Ficoll分離獲得的人外周血單個(gè)核細(xì)胞共孵育后，能夠恢復(fù)腫瘤細(xì)胞裂解液對(duì)單個(gè)核細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)；（3）在體外，將人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)成DC，并用Ad-PL-PPT-E1A或者Ad-PL感染的前列腺癌細(xì)胞裂解液致敏，兩天后，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-PL-PPT-E1A和Ad-PL均能上調(diào)DC表面分子CD80、CD83和CD86；real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，DC成熟相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)果表明，溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A能夠增強(qiáng)LNCaP細(xì)胞裂解液對(duì)DC成熟的促進(jìn)作用。 最后，我們檢測(cè)了溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。首先，采用皮下荷瘤方式成功建立了人前列腺癌細(xì)胞PC3M的裸鼠移植瘤模型，分次瘤內(nèi)給藥進(jìn)行治療（2×108IU/100μl/次，連續(xù)給藥5天），觀察腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，與Ad-Null組相比，Ad-PL-PPT-E1A和Ad-PPT-E1A能夠明顯提高小鼠的存活率和抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其中，Ad-PL-PPT-E1A表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)；同時(shí)，real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-PL-PPT-E1A可高效介導(dǎo)目的基因PL和E1A在移植瘤中的表達(dá)。 綜上所述，Ad-PL-PPT-E1A能夠在體外發(fā)揮前列腺癌特異性復(fù)制和溶瘤作用；同時(shí)，Ad-PL-PPT-E1A能夠在體外增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的免疫激活作用。此外，Ad-PL-PPT-E1A能夠抑制前列腺癌細(xì)胞PC3M移植瘤的生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，Ad-PL-PPT-E1A結(jié)合了溶瘤腺病毒和免疫基因治療的優(yōu)勢(shì)，有望成為前列腺癌治療的基因治療候選藥物。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2564370