【摘要】：前列腺癌是西方國家最為常見的男性惡性腫瘤之一。近年來，隨著人口老齡化和飲食結構的改變，我國前列腺癌的發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅著老年人口的生活質量和預期壽命。前列腺癌的病程進展緩慢，早期采用前列腺切除術可顯著提高治愈率；但當晚期發(fā)生轉移時，一般采用放化療、內分泌療法等手段，但治愈率低，10年生存率不足10%，而且易導致其進展為激素非依賴型前列腺癌�？傊壳皩τ谕砥�、轉移及激素非依賴型患者仍然缺乏有效手段，因此，亟需尋找一種新的治療方案。 基因治療能有效針對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個關鍵環(huán)節(jié)，已成為提升前列腺癌治療水平的重要力量。目前，已有多項前列腺癌基因治療藥物處于臨床試驗階段。溶瘤病毒和免疫基因治療是基因治療的兩大重要方向。溶瘤腺病毒不但能夠在腫瘤細胞中特異性復制并殺傷腫瘤細胞，而且還能介導治療基因在的高效表達，進而發(fā)揮療效；而免疫基因治療，能夠通過向腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境導入免疫基因或免疫調節(jié)基因，激活機體抗腫瘤免疫反應。有研究表明，CD40L與腫瘤抗原融合表達，可以通過CD40與CD40L的相互作用，將腫瘤抗原靶向樹突狀細胞（Dendritic Cell, DC），進一步激活T淋巴細胞和特異性抗腫瘤免疫反應。本課題組前期工作中，集合溶瘤腺病毒與免疫基因治療的優(yōu)勢，構建了攜帶前列腺特異性抗原（Prostate SpecificAntigen，PSA）和CD40L融合蛋白基因（PSA-CD40L，PL）的前列腺癌特異性溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A，并進行了初步評價。本課題將在以往工作基礎上，系統(tǒng)評價Ad-PL-PPT-E1A的體外溶瘤及免疫激活效應，，同時，探討其體內抗腫瘤效應。 首先，在已經制備攜帶PL基因的前列腺癌特異性溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A和非溶瘤對照病毒Ad-PL的基礎上，采用本實驗室建立的以Adeasy系統(tǒng)為基礎的溶瘤腺病毒構建體系，構建和制備單純溶瘤對照病毒Ad-PPT-E1A。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法鑒定病毒基因組，采用蛋白印記（Western-blotting）檢測目的基因（PL、E1A）的表達。鑒定正確后，大量擴增病毒，采用氯化銫（Caesium Chloride，CsCl）密度梯度離心純化病毒，TCID50法測定其感染滴度為6×1011IU/ml。 接著，在體外分別對Ad-PL-PPT-E1A的特異性復制和溶瘤效應進行評價：（1）5MOI溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A及陽性對照病毒Ad-TPE-CD80-GM感染前列腺癌細胞PC3、PC3M、DU145、LNCaP，以及對照細胞L02、HepG2、Hela后，分別于感染后24h、48h和72h收集細胞和上清，TCID50測定病毒活性，結果顯示，前列腺癌細胞中病毒活性呈時間依賴性增加，而在非前列腺癌細胞中無明顯改變，表明Ad-PL-PPT-E1A具有前列腺癌特異性的復制能力；（2）為進一步明確病毒復制的機制，我們在前列腺癌細胞中，采用Western-blotting和real-time PCR方法分別檢測了Ad-PL-PPT-E1A介導的腺病毒復制必需基因E1A的表達，結果顯示，E1A的表達在前列腺癌細胞中呈現劑量和時間依賴性的增加，與病毒活性檢測結果一致；（3）病毒復制可造成細胞裂解和死亡，流式細胞檢測結果顯示，Ad-PL-PPT-E1A和單純溶瘤對照病毒Ad-PPT-E1A能夠有效殺傷前列腺癌細胞，并呈時間和劑量依賴性的增加，而對照病毒Ad-PL對前列腺癌細胞凋亡無明顯影響；（4）同時，結晶紫檢測結果顯示，溶瘤腺病毒具有前列腺癌特異性殺傷效應：例如，感染后6d，0.1MOI Ad-PL-PPT-E1A對激素依賴性前列腺癌細胞LNCaP的殺傷率可達99%；10MOI Ad-PL-PPT-E1A對激素非賴性前列腺癌細胞PC3M的殺傷率為70%左右，而10MOI的Ad-PL-PPT-E1A其對正常細胞及其他類型腫瘤細胞無明顯的殺傷作用。 接下來，我們對Ad-PL-PPT-E1A的體外免疫激活效應進行了評價。（1）溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A感染前列腺癌細胞后，real-time PCR檢測結果顯示，嵌合免疫基因PL表達呈現劑量和時間依賴性增加；（2）將感染Ad-PL-PPT-E1A的前列腺癌細胞裂解液，與Ficoll分離獲得的人外周血單個核細胞共孵育后，能夠恢復腫瘤細胞裂解液對單個核細胞增殖的抑制效應；（3）在體外，將人外周血單個核細胞誘導成DC，并用Ad-PL-PPT-E1A或者Ad-PL感染的前列腺癌細胞裂解液致敏，兩天后，流式細胞檢測結果顯示，Ad-PL-PPT-E1A和Ad-PL均能上調DC表面分子CD80、CD83和CD86；real-time PCR檢測結果顯示，DC成熟相關細胞因子的表達增強。結果表明，溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A能夠增強LNCaP細胞裂解液對DC成熟的促進作用。 最后，我們檢測了溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A的體內抗腫瘤效應。首先，采用皮下荷瘤方式成功建立了人前列腺癌細胞PC3M的裸鼠移植瘤模型，分次瘤內給藥進行治療（2×108IU/100μl/次，連續(xù)給藥5天），觀察腫瘤生長狀態(tài)和生長曲線，結果顯示，與Ad-Null組相比，Ad-PL-PPT-E1A和Ad-PPT-E1A能夠明顯提高小鼠的存活率和抑制腫瘤的生長，其中，Ad-PL-PPT-E1A表現出更強的抗腫瘤效應；同時，real-time PCR檢測結果顯示，Ad-PL-PPT-E1A可高效介導目的基因PL和E1A在移植瘤中的表達。 綜上所述，Ad-PL-PPT-E1A能夠在體外發(fā)揮前列腺癌特異性復制和溶瘤作用；同時，Ad-PL-PPT-E1A能夠在體外增強前列腺癌細胞的免疫激活作用。此外，Ad-PL-PPT-E1A能夠抑制前列腺癌細胞PC3M移植瘤的生長。上述結果表明，Ad-PL-PPT-E1A結合了溶瘤腺病毒和免疫基因治療的優(yōu)勢，有望成為前列腺癌治療的基因治療候選藥物。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

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1 張金合;戴平;;溶瘤腺病毒的靶向性策略[J];生命的化學;2006年01期

2 鞠林成;劉赫;劉學鋒;吳斌;;前列腺癌標記物的研究及最新進展[J];現代腫瘤醫(yī)學;2010年04期

3 王振發(fā);王烈;衛(wèi)立辛;;基因治療病毒載體的研究進展[J];醫(yī)學綜述;2007年07期

4 畢新剛;韓仁強;周金意;張思維;鄭榮壽;武鳴;陳萬青;;2009年中國前列腺癌發(fā)病和死亡分析[J];中國腫瘤;2013年06期

本文編號：2564370