【摘要】：目的：腎癌對放化療不敏感,對于腎癌的治療目前仍以手術(shù)治療為主,由于早期缺乏敏感及特異的檢測指標(biāo),30%的患者發(fā)現(xiàn)腫瘤已經(jīng)有了轉(zhuǎn)移。因此亟待尋求一種新的基因位點作為腎癌早期篩查標(biāo)記以及生物治療的靶點,研究熱門的microRNA有望成為新的研究目標(biāo)。本研究選擇miR-107作為研究對象,主要通過體內(nèi)外實驗來評估m(xù)iR-107在透明細(xì)胞腎癌中的作用效果,并進(jìn)一步探討其在腫瘤中發(fā)揮作用的機(jī)制。材料與方法：通過qRT-PCR檢測miR-107在52對透明細(xì)胞腎癌組織及對應(yīng)癌旁組織中中表達(dá)水平的不同,并進(jìn)一步在三種腎細(xì)胞系786-0, ACHN和HKC中驗證表達(dá)的差異性,通過轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的模擬生物體內(nèi)源的rniR-107 mimics及感染重組的過表達(dá)miR-107慢病毒質(zhì)粒來研究miR-107對透明細(xì)胞腎癌細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制。為了明確在透明細(xì)胞腎癌中miR-107發(fā)揮作用的靶基因,我們在運用生物信息學(xué)預(yù)測可能的靶基因的基礎(chǔ)上,利用熒光素酶試驗以及Western Blot等方法證實了EIF5基因是miR-107發(fā)揮作用靶基因。同時通過Western Blot、qRT-PCR等手段發(fā)現(xiàn)p53、VHL等多個基因參與miR-107在透明細(xì)胞腎癌組織中發(fā)揮抑癌作用。結(jié)果：利用qRT-PCR的方法,發(fā)現(xiàn)相對于正常組織,miR-107在透明細(xì)胞腎癌組織中表達(dá)明顯下調(diào);同樣地,相對于正常腎臟上皮細(xì)胞,miR-107在透明細(xì)胞腎癌細(xì)胞系中表達(dá)是明顯下降。體外實驗中,過表達(dá)的miR-107的透明細(xì)胞腎癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力受到明顯抑制,裸鼠體內(nèi)實驗證實過表達(dá)的miR-107可以抑制腎癌腫瘤的生長。miR-107對腎癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的機(jī)制探索方面,miR-107能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。證實了在透明細(xì)胞腎癌中EIF5是miR-107發(fā)揮作用的靶基因,Notch2、NF1以及VEGFA是miR-107潛在的可能的靶基因,p53和VHL等基因共同參與調(diào)節(jié)miR-107表達(dá)水平。結(jié)論：在多種基因參與調(diào)節(jié)下,miR-107以EIF5作為靶基因在透明細(xì)胞腎癌中,通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,從而發(fā)揮抑制腎癌細(xì)胞增殖及侵襲,影響腫瘤生長的作用。
【圖文】：

解放軍醫(yī)學(xué)院博±學(xué)位論文逡逑調(diào)ｔｒＷ及細(xì)胞周期情況。從圖５Ａ可Ｗ看出，相對于轉(zhuǎn)染了邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎ仕0１的７８６－０逡逑細(xì)胞來說，轉(zhuǎn)染了邋ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ的細(xì)胞周期在Ｇ２Ｍ峰值上有明顯差異，，通過逡逑統(tǒng)計軟件ＳＰＳＳ的統(tǒng)計分析可Ｗ看出（圖５Ｂ）在Ｇ２Ｍ期細(xì)胞的百分率方面有明逡逑顯統(tǒng)計學(xué)差異，公＜０．０５；轉(zhuǎn)染了邋ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ的細(xì)胞是ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ組細(xì)胞逡逑在Ｇ２Ｍ期百分?jǐn)?shù)的２．１９倍。據(jù)此可Ｗ證實過表達(dá)ｍｉＲ－１０７的腎癌細(xì)胞發(fā)生了明逡逑顯的周期阻滯，ｍｉＲ－１０７可Ｗ誘導(dǎo)透明細(xì)胞腎癌細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，將細(xì)胞周期逡逑阻滯在Ｇ２Ｍ期。而另一方面，在細(xì)胞調(diào)亡方面，我們也做了一定的探索，同樣逡逑的將透明細(xì)胞腎癌７８６－０細(xì)胞系隨機(jī)分為兩個組，即轉(zhuǎn)染ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ組和轉(zhuǎn)逡逑染ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ組，在轉(zhuǎn)染后的４８小時，收細(xì)胞利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞調(diào)亡，逡逑由圖５Ｃ和Ｄ可Ｗ看出，兩組之間在細(xì)胞調(diào)亡方面沒有明顯的差異，利用統(tǒng)計學(xué)逡逑軟件分析兩組間細(xì)胞調(diào)亡率

ｍ化－１０７在腎癌中發(fā)揮重要作用的靴基因，我們Ｗ邋ｐｓｉuQＥＣＫＴＭ－２質(zhì)粒為載體，逡逑在軟件預(yù)測ＥＩＦ５可能的靴基因位點為指導(dǎo)，在ＥＩＦ５的３’－ＵＴＲ區(qū)的３２－３９位點和逡逑３５５５－３５６２位點構(gòu)建了相應(yīng)的突變體（圖７Ａ和Ｃ），利用Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｍｓｅ？雙巧逡逑光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，由圖７Ｂ和Ｃ可Ｗ看出，在３２－３９位點和３５５５－３Ｗ２逡逑兩個位點，ｍｉＲ－１０７對￡陽５均有＾定的抑制作用。在３２－３９位點，巧光素酶活性逡逑被抑制了邋４５．９％邋（孤＝０．７０＆＾＜０．0巧，而在３５５５－３５６２位點巧光素酶活性被抑制了逡逑１６．８％邋（ＳＤ邋＝邋０．０９８，邋０．０／＜ｐ邋＜０．０５）。因此可Ｗ明確ＥW'５是ｍ化－１０７在透明細(xì)胞腎逡逑５８逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 Valerio Del Vescovo;Margherita Grasso;Mattia Barbareschi;Michela A Denti;;Micro RNAs as lung cancer biomarkers[J];World Journal of Clinical Oncology;2014年04期

本文編號：2564434