發(fā)布時間：2019-11-22 10:30

【摘要】：目的：腎癌對放化療不敏感,對于腎癌的治療目前仍以手術治療為主,由于早期缺乏敏感及特異的檢測指標,30%的患者發(fā)現腫瘤已經有了轉移。因此亟待尋求一種新的基因位點作為腎癌早期篩查標記以及生物治療的靶點,研究熱門的microRNA有望成為新的研究目標。本研究選擇miR-107作為研究對象,主要通過體內外實驗來評估m(xù)iR-107在透明細胞腎癌中的作用效果,并進一步探討其在腫瘤中發(fā)揮作用的機制。材料與方法：通過qRT-PCR檢測miR-107在52對透明細胞腎癌組織及對應癌旁組織中中表達水平的不同,并進一步在三種腎細胞系786-0, ACHN和HKC中驗證表達的差異性,通過轉染化學合成的模擬生物體內源的rniR-107 mimics及感染重組的過表達miR-107慢病毒質粒來研究miR-107對透明細胞腎癌細胞的作用及其作用機制。為了明確在透明細胞腎癌中miR-107發(fā)揮作用的靶基因,我們在運用生物信息學預測可能的靶基因的基礎上,利用熒光素酶試驗以及Western Blot等方法證實了EIF5基因是miR-107發(fā)揮作用靶基因。同時通過Western Blot、qRT-PCR等手段發(fā)現p53、VHL等多個基因參與miR-107在透明細胞腎癌組織中發(fā)揮抑癌作用。結果：利用qRT-PCR的方法,發(fā)現相對于正常組織,miR-107在透明細胞腎癌組織中表達明顯下調;同樣地,相對于正常腎臟上皮細胞,miR-107在透明細胞腎癌細胞系中表達是明顯下降。體外實驗中,過表達的miR-107的透明細胞腎癌細胞的增殖及侵襲能力受到明顯抑制,裸鼠體內實驗證實過表達的miR-107可以抑制腎癌腫瘤的生長。miR-107對腎癌細胞發(fā)揮抑制作用的機制探索方面,miR-107能夠誘導細胞周期阻滯在G2/M期。證實了在透明細胞腎癌中EIF5是miR-107發(fā)揮作用的靶基因,Notch2、NF1以及VEGFA是miR-107潛在的可能的靶基因,p53和VHL等基因共同參與調節(jié)miR-107表達水平。結論：在多種基因參與調節(jié)下,miR-107以EIF5作為靶基因在透明細胞腎癌中,通過誘導細胞周期阻滯在G2/M期,從而發(fā)揮抑制腎癌細胞增殖及侵襲,影響腫瘤生長的作用。
【圖文】：

解放軍醫(yī)學院博±學位論文逡逑調ｔｒＷ及細胞周期情況。從圖５Ａ可Ｗ看出，相對于轉染了邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎ仕0１的７８６－０逡逑細胞來說，轉染了邋ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ的細胞周期在Ｇ２Ｍ峰值上有明顯差異，，通過逡逑統(tǒng)計軟件ＳＰＳＳ的統(tǒng)計分析可Ｗ看出（圖５Ｂ）在Ｇ２Ｍ期細胞的百分率方面有明逡逑顯統(tǒng)計學差異，公＜０．０５；轉染了邋ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ的細胞是ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ組細胞逡逑在Ｇ２Ｍ期百分數的２．１９倍。據此可Ｗ證實過表達ｍｉＲ－１０７的腎癌細胞發(fā)生了明逡逑顯的周期阻滯，ｍｉＲ－１０７可Ｗ誘導透明細胞腎癌細胞發(fā)生周期阻滯，將細胞周期逡逑阻滯在Ｇ２Ｍ期。而另一方面，在細胞調亡方面，我們也做了一定的探索，同樣逡逑的將透明細胞腎癌７８６－０細胞系隨機分為兩個組，即轉染ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ組和轉逡逑染ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ組，在轉染后的４８小時，收細胞利用流式細胞儀測定細胞調亡，逡逑由圖５Ｃ和Ｄ可Ｗ看出，兩組之間在細胞調亡方面沒有明顯的差異，利用統(tǒng)計學逡逑軟件分析兩組間細胞調亡率

ｍ化－１０７在腎癌中發(fā)揮重要作用的靴基因，我們Ｗ邋ｐｓｉuQＥＣＫＴＭ－２質粒為載體，逡逑在軟件預測ＥＩＦ５可能的靴基因位點為指導，在ＥＩＦ５的３’－ＵＴＲ區(qū)的３２－３９位點和逡逑３５５５－３５６２位點構建了相應的突變體（圖７Ａ和Ｃ），利用Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｍｓｅ？雙巧逡逑光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，由圖７Ｂ和Ｃ可Ｗ看出，在３２－３９位點和３５５５－３Ｗ２逡逑兩個位點，ｍｉＲ－１０７對￡陽５均有＾定的抑制作用。在３２－３９位點，巧光素酶活性逡逑被抑制了邋４５．９％邋（孤＝０．７０＆＾＜０．0巧，而在３５５５－３５６２位點巧光素酶活性被抑制了逡逑１６．８％邋（ＳＤ邋＝邋０．０９８，邋０．０／＜ｐ邋＜０．０５）。因此可Ｗ明確ＥW'５是ｍ化－１０７在透明細胞腎逡逑５８逡逑
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11

【參考文獻】

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1 Valerio Del Vescovo;Margherita Grasso;Mattia Barbareschi;Michela A Denti;;Micro RNAs as lung cancer biomarkers[J];World Journal of Clinical Oncology;2014年04期

本文編號：2564434